[发明专利]利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法

权利要求书

1.利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法，其特征是包括以下步骤：

1）、宫内膜干细胞的分离培养和扩增：

将经血经含抗生素的杀菌液的杀菌处理后，离心，去上清液；然后加入Chang氏通用培养基置于4~6%CO₂、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱中培养；

培养5~7天后换液去除未贴壁细胞；一旦细胞生长至75~85%汇合度时，即采用胰酶消化传代；

2）、体外诱导分化：

A、将上述步骤1）所得的第2~4代生长状况良好的细胞以胰酶消化，当显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含体积浓度9~11%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，所得的细胞沉淀用PBS清洗；

B、将上述步骤A所得的经PBS清洗后的细胞沉淀接种于6孔板中进行诱导培养，接种细胞密度为4.8×10⁵~5.2×10⁵/孔，每孔加1ml的 Chang氏通用培养基；在36~38℃、4~6%CO₂、94~96%饱和湿度的培养箱中培养；

C、选择以下任意1个体系进行：

体系1：待细胞生长密度到达80-90%时，向各孔中加入5-氮胞苷混匀，使5-氮胞苷达到终浓度为9~11μM； 5-氮胞苷处理细胞22~26小时后，吸弃孔内培养基，用PBS清洗细胞2次；更换成1ml的诱导培养基I；然后置于36~38℃、4~6%CO₂、94~96%饱和湿度的培养箱中培养；随后进行下述步骤D；

诱导培养基I的制备方法为：在1ml的Chang氏通用培养基中加入0.018~0.022ml的FBS（胎牛血清）、39~41ng的 HGF（人肝细胞生长因子）、 19~21ng的EGF（人表皮生长因子）, 加入DEX（地塞米松）使浓度为49~51nM，加入0.008~0.012ml的ITS premix；

体系2：待细胞完全贴壁后，吸弃孔内培养基，更换成1ml的诱导培养基II；然后置于5%CO₂，95%饱和湿度的37℃培养箱中进行培养；随后进行下述步骤D；

诱导培养基Ⅱ的制备方法为：在1ml的Chang氏通用培养基中加入0.018~0.022ml的FBS、19~21ng的 HGF（人肝细胞生长因子）、9~11ng的 FGF-4（人成纤维细胞生长因子-4）、9~11ng的OSM（重组人致瘤素M）、39~41ng的 DEX（地塞米松），加入0.008~0.012ml的ITS premix（胰岛素-转铁蛋白-硒复合物）；

D、2-3天半量换液一次，每日在倒置显微镜下观察细胞状态；诱导时间为20~22天，得具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞。

2.根据权利要求1所述的利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法，其特征是所述步骤1）依次为： 

①、经血收集：

在采集管内设置20ml的Hank's平衡盐溶液，并添加以下成分至以下浓度：万古霉素60~100 μg/mL、头孢氨苄150~350 μg/mL、卡那霉素50~150 μg/mL、庆大霉素80~160 μg/mL、两性霉素B 2~3μg/mL及300~500单位肝素钠； 以此作为含抗生素的杀菌液；

将15~20ml的经血放入上述采集管内，于4℃的低温下保存24~48小时；然后离心，去上清液； 

②、原代培养：

A）、取6~10ml的Chang氏通用培养基加入到步骤①所得物中；

B）、将步骤A）的所得物放入培养瓶中置于4~6%CO₂、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱内培养；培养5~7天后全量换液；再将上述培养瓶直立3~8分钟，从而使未贴壁的细胞滑落至培养瓶底部，用移液管去除培养瓶中的培养基；

C）、在步骤B）所得的培养瓶中加入2~4 mL的Chang氏通用培养基进行润洗，然后用移液管去除培养瓶中的培养基；

D）、在步骤C）所得的培养瓶中加入6~10 mL的Chang氏通用培养基，置于4~6%CO₂、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱内培养；

所述Chang氏通用培养基的配制方法如下：在无菌条件下，在无菌容器中加入650mL MEM-alpha 培养基、160~200mL的 Chang B基液、10~30mL的 Chang C基液、5~15 mL 青霉素/链霉素双抗 (10,000 U/mL苄青霉素钠，10,000 μg/mL链霉素)，5~15 mL的浓度为 200 mM的L-谷氨酰胺、130~170 mL的胎牛血清；充分混匀，高压蒸汽灭菌后放入4℃冰箱保存待用；

③、细胞传代培养：

一旦步骤②原代培养的细胞生长至75~85%汇合度时，即采用胰酶消化传代；具体如下：

A）、一旦步骤②原代培养的细胞生长至75~85%汇合度时，去除培养液，然后用无钙镁离子的PBS进行洗涤；

B）、加入1~2ml胰酶，置于4~6%CO₂、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱中孵育4~6分钟；

C）、加入4~6ml的Chang氏通用培养基使胰酶失活；

D）、轻柔吹打，使贴壁细胞脱落并成单细胞状态；

E）、按1：4的比率传代；

F）、在每1ml的细胞悬液中加入2~4ml的Chang氏通用培养基；然后置于4~6%CO₂、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱中培养。