[发明专利]利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法。

背景技术

原位肝移植是终末期肝病治疗的金标准。然而，肝源的短缺成为了肝细胞移植在临床应用上最大的瓶颈。所以，找到合适的、丰富的肝细胞来源是现在生物学领域研究的热点。1981年Evans等人建立了第一个小鼠ES细胞系，以其为模型，研究已证实小鼠ES细胞在体外不仅可以诱导分化为肝祖细胞，而且可以进一步分化为有功能的肝细胞。有动物实验表明，将体外分化得到的肝细胞移植入肝损伤模型体内，移植细胞能够融合到肝脏组织，并缓解小鼠的肝损伤状况，且移植3个月内未发现畸胎瘤和肿瘤的形成。人ES细胞的成功建立打开了体外产生可供移植治疗的所有类型的人体细胞、组织乃至器官的大门。多数研究者利用各种成体干细胞在体外诱导分化为肝脏细胞，并研究其作用于急性肝损伤的动物模型，如腹腔注射四氯化碳、烯丙胺及倒千里光碱等造成的肝持续性纤维化，以及构建肝部分切除动物模型。这些研究中，均对诱导分化后的细胞进行功能特性等研究，如形态学观察，细胞表面抗原，成熟肝脏细胞所具有的糖原合成储备、尿素产生、分泌白蛋白功能，肝脏细胞特异性蛋白（Alb, AFP等）的表达进行了研究。至今已有经由骨髓间充质肝细胞、胚胎干细胞、脐带及脐带血干细胞、胎盘间充质干细胞等向肝细胞方向分化的报道。然而，由于骨髓的有创来源、胚胎干细胞等的致畸胎瘤性，使其面临伦理学的争议。

2007年，Masuda等研究证实宫内膜细胞符合干细胞的标准。宫内膜细胞具有与人成体干细胞相同的多向分化潜能、表达细胞表面标志物的能力以及贴壁生长的特点。宫内膜干细胞能表达干细胞表面标志物，如CD9, CD29, CD41a, CD44, CD59, CD73,CD90和CD105等。但一些造血干细胞表面标志物（如CD34和CD45等）则为阴性。经血干细胞体外能长期培养而保持染色体组型的稳定性不变，且其增殖分化潜能明显高于脐带血间充质干细胞。Borlongan 等利用经血干细胞与外周血淋巴细胞共培养发现其并不能刺激淋巴细胞增殖，也就是说其免疫原性低，这为细胞移植的安全性提供了一定的保证。经血干细胞能通过非侵入性手段轻易获得，能利用标准的实验室条件达到很好的扩增和定向分化结果。

目前，已有报道经血干细胞具有可成脂肪细胞、骨与软骨、神经细胞及心肌细胞肺上皮，胰岛细胞等三个胚层的许多细胞分化的能力。有文献报道，经血干细胞成功定向分化为心肌细胞，并研究了该干细胞在心肌梗死动物模型中发挥的作用，发现其可一定程度缓解梗死灶、恢复心肌收缩功能。Toyoda等报道月经血干细胞具有肌源性分化，从而在杜氏肌营养不良的恢复中发挥重要作用。Murphy 则发现这种细胞在肢段缺血动物中能够产生一些生长因子，抑制炎症反应并且能够在宿主体内得到增殖。台湾国立大学的Li将宫内膜干细胞在体外诱导成能产生胰岛素的细胞，并将其用于治疗Ⅰ型糖尿病，取得了很好的效果，发现细胞移植后能有效的控制血糖水平，且移植的干细胞在小鼠胰岛内发生分化也被观察。还有研究称月经血干细胞不仅仅能表达干细胞特定表型标志，而且在实验动物模型中能发挥一定的神经保护作用，这一发现具体体现在耶鲁大学和南佛罗里达大学的两个研究组将其用于帕金森和中风的动物模型。经血干细胞不仅能够向神经元方向分化而且在修复脑血管损伤上起重要作用。另外，有研究称，脐带间充质干细胞可以定向分化为低免疫原性的肝细胞样细胞。理论上，经血干细胞仅低表达人类白细胞抗原Ⅰ型，不表达人类白细胞抗原Ⅱ型。这为解决异体细胞移植后所必然发生的排异反应提供了很大突破点。目前，尚无关于经血干细胞定向分化为肝脏细胞的研究报道。

经血干细胞是最近发现的成体干细胞的一种，属于间充质干细胞（MSC）。子宫内膜组织内发现存在丰富的间充质干细胞，在月经期间随经血排出体外，是一种无创、安全的干细胞来源方式。在细胞标记分子表达和细胞增殖、分化能力上，经血干细胞与胚胎干细胞更相似。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法，包括以下步骤：

1）、宫内膜干细胞的分离培养和扩增：

将经血经含抗生素的杀菌液的杀菌处理后，离心，去上清液；然后加入Chang氏通用培养基置于4~6%CO₂、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱中培养；

培养5~7天后换液去除未贴壁细胞；一旦细胞生长至75~85%汇合度时，即采用胰酶消化传代；

2）、体外诱导分化：