[发明专利]一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性检测方法

摘要

本发明公开了一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测方法，即首次采用生物发光共振能量转移技术和化学发光技术免疫检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性：将链亲和素-荧光素酶融合蛋白与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在0～40℃孵育30～60min，再加入荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体，0～40℃孵育30～60min，然后再加入荧光素底物，4～30℃下静置5～30min，检测670nm处的发光强度，进而计算获得O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性；本发明方法操作简便，应用范围广，避免了外源激发光所引起的散射和样品基质荧光等本底的干扰，具有更高的灵敏度和准确度。

主权项

一种O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶活性检测方法，其特征在于所述方法为：（1）将O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶与生物素标记的O6‑甲基鸟嘌呤反应，获得生物素标记的O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶；（2）将链亲和素‑荧光素酶融合蛋白与生物素标记的O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶在0~40℃孵育30~60min，使链亲和素‑荧光素酶融合蛋白中的链亲和素与生物素标记的O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶中的生物素结合，形成O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶‑生物素与链亲和素结合体‑荧光素酶融合蛋白复合物，再加入荧光染料标记的O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶抗体，0~40℃孵育30~60min，使荧光染料标记的O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶抗体与O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶‑生物素与链亲和素结合体‑荧光素酶融合蛋白复合物一端的O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶结合，形成荧光染料标记的O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶‑生物素与链亲和素结合体‑荧光素酶融合蛋白复合物，然后再加入荧光素底物，4~30℃下静置5~30min，使荧光染料标记的O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶‑生物素与链亲和素结合体‑荧光素酶融合蛋白复合物中的荧光素酶融合蛋白与荧光素底物反应产生发光物质，检测670nm处的发光强度，根据O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶浓度与所述发光强度的相关标准曲线计算出生物素标记的O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶的含量，进而根据公式（1）计算获得O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶活性；所述O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶活性的定义为：在37℃条件下，1min内能转化生物素标记的O6‑甲基鸟嘌呤生成1微摩尔的生物素标记的O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶所需的O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶酶量为一个酶活单位；公式（1）：z=[(y‑b)/aMt]×106其中y=ax+b：a和b均为常数项，x为生物素标记的O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶的含量，y为吸光值，z为O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶活性， M为生物素标记的O6‑甲基鸟嘌呤‑DNA甲基转移酶分子量，t为反应时间。