[发明专利]一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性检测方法

权利要求书

1.一种O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性检测方法，其特征在于所述方法为：（1）将O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶与生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤反应，获得生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶；（2）将链亲和素-荧光素酶融合蛋白与生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在0~40℃孵育30~60min，使链亲和素-荧光素酶融合蛋白中的链亲和素与生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶中的生物素结合，形成O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物，再加入荧光染料标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体，0~40℃孵育30~60min，使荧光染料标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体与O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物一端的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶结合，形成荧光染料标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物，然后再加入荧光素底物，4~30℃下静置5~30min，使荧光染料标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物中的荧光素酶融合蛋白与荧光素底物反应产生发光物质，检测670nm处的发光强度，根据O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶浓度与所述发光强度的相关标准曲线计算出生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的含量，进而根据公式（1）计算获得O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性；所述O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的定义为：在37℃条件下，1min内能转化生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤生成1微摩尔的生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶所需的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶酶量为一个酶活单位；

公式（1）：z=[(y-b)/aMt]×10⁶

其中y=ax+b：a和b均为常数项，x为生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的含量，y为吸光值，z为O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性， M为生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶分子量，t为反应时间。

2.如权利要求1所述O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性检测方法，其特征在于步骤（1）所述生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的生物素标记方法为：将O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶与生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤混合，充分混匀后0~40℃下水浴0.5~4h，反应结束后，将反应液加入14KD的透析袋中，用pH为6.4的TBS缓冲溶液为透析液在4℃下透析，然后将截留液用凝胶琼脂分子筛过滤，取滤液，即获得生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶。

3.如权利要求2所述O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性检测方法，其特征在于所述的透析每隔3~5h更换一次透析液，总共更换三次。

4.如权利要求1所述O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性检测方法，其特征在于步骤（2）所述荧光素底物为与荧光素酶融合蛋白相对应的化学发光底物。