[发明专利]一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性检测方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测方法，特别涉及采用生物发光共振能量转移技术和化学发光技术免疫检测O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的方法。 

（二）背景技术

烷化剂是最大一类抗肿瘤药物，临床上常用的例子有环磷酰胺、尼莫司汀、卡巴嗪、硝卡芥、氮芥和替莫唑胺等，广泛用于治疗脑、头颈、肝、食管、肺、泌尿、生殖、血液等恶性肿瘤。烷化剂药物对肿瘤细胞的杀伤主要是通过对DNA分子的鸟嘌呤O⁶位上的烷基化而实现的，而O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O⁶-Methylguanine DNA-Methyltransferase,MGMT）的存在能够去除这种烷基加合物，使肿瘤细胞和正常细胞得以生存而产生所谓的耐药性，是哺乳动物细胞修复烷化剂所造成DNA损伤的一个重要环节。其作用机理是：将烷基加合物从O⁶-鸟嘌呤的O⁶位转移到自身半胱氨酸残基上，使DNA链上的鸟嘌呤复原，同时自身不可逆的失活，以此方式来实现修复。如果肿瘤细胞中的MGMT水平过高可能会导致耐药，而对于正细胞却可能减少其化疗的毒副作用。如何控制MGMT水平以达到最佳的化疗效果是如今MGMT研究的热点。而且，MGMT在预测肿瘤化疗的效果以及制订个体化治疗方案的潜在价值已被大量实例研究所证实并被医学界广泛认可。因此，如何灵敏、准确地检测MGMT在细胞中的含量，对提高化疗效果以及减少药物毒副作用有着重要的意义。 

目前还没有一种简易可靠、可应用于常规临床检验的方法来测定MGMT的活性。大量文献描述MGMT基因启动子甲基化以及MGMT蛋 白表达的免疫测定，并试图建立这些分子生物学和血清学指标与肿瘤耐药性、生存率以及个体化治疗方案的相关性，但这些烦琐而且不稳定的检测方法不适合在临床上常规使用，而且它们不直接测定MGMT的酶学活性可能会引入各种与肿瘤耐药机制无关的干扰因素。而基于同位素标记底物的MGMT活性测定法只适用于实验室研究，而难以被用于常规临床检验中。此外，这种方法所用的蛋白沉淀步骤容易引入诸如黑色素(Melanin)等蛋白的非特异结合所引起的假阳性。也有人用非同位素标记的底物和酶联免疫分析方法来测定MGMT活性，但这个方法所需的多步而费时的固相分离和反应从临床应用和检测效率（灵敏度）的角度来看是个明显的缺点。 

上世纪末Xu Y.等人发现，荧光素酶（Luciferase）和荧光素反应所产生的生物发光可以转移并激发与之靠近的荧光色团，这就是所谓的生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer,BRET）现象。如果将荧光素酶和荧光色团分别标记在有亲和力的两个生物分子上，那么这对分子的结合就可以通过因这种结合所带来的BRET所表示出来。这种BRET技术具有匀相检测（即不需要分离）以及无激发本底两个优点，且具备操作简便和高灵敏度两大方法学优势，很快就在研究蛋白质相互作用以及亲合结合分析方面得到了广泛的应用。尽管这样，到目前为止还没有应用BRET来测定MGMT活性的报道。 

本发明结合化学发光技术，首次提出采用BRET的方法测定O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性，该方法利用BRET技术和化学发光技术的优势来解决临床常规MGMT活性测定难题，将为个体化的肿瘤治疗的现代临床实践提供技术支撑。 

（三）发明内容

本发明目的是提供一种O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测 方法，该方法为操作简便、特异性好和灵敏度高的匀相MGMT活性测定方法。 

本发明采用的技术方案是： 

一种O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测方法，所述方法为： 

（1）将待测O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶与生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤反应，获得生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶，所述生物素为维生素H；