[发明专利]大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用

摘要

本发明公开了一种大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用，其步骤是：1)根据GSIV-MCP基因序列，设计引物；2)用EPC细胞培养GSIV，抽提病毒核酸为模板，PCR扩增；3)将纯化的PCR产物插入到PET-32(a)，得到重组表达载体；4)重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组菌株；5)使用不同IPTG浓度及不同的诱导时间诱导重组菌株，获得最佳诱导条件；6)经过诱导的重组菌株经超声波破碎处理，经蛋白纯化试剂盒纯化，得到纯化的重组蛋白；7)纯化后的重组蛋白采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。该多克隆抗体经ELISA效价检测，具有滴度高，特异性强。为GSIV的快速检测试剂盒及大鲵病毒性出血病的防治奠定基础。

主权项

一种大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白GSIV‑MCP的原核表达、多克隆抗体的制备方法，其步骤是：1)根据GSIV‑MCP基因序列，设计特异性引物：PET‑MCP‑FP：5´‑CGGAATTCATGTCTTCTGTAACCG‑3´，含有EcoRⅠ 酶切位点；PET‑MCP‑RP：5´‑CCAAGCTTTTACAAGATTGGGAATC‑3´，含有HindⅢ 酶切位点；GSIV‑MCP基因为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；2) 用EPC细胞培养GSIV，病毒DNA提取试剂盒抽提病毒核酸为模板，进行PCR扩增，PCR采用50μL反应体系：10×PCR Buffer 5μL，10mmol/L dNTP 1μL，Primers：10μmol/L PET‑MCP‑FP和10μmol/L PET‑MCP‑RP各1μL，5U/μL rTaq DNA聚合酶0.5μL，DNA 模板为1μL，ddH2O补足至50μL；PCR扩增程序为：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸10 min；PCR 产物经1.0%w/v琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR产物及胶回收试剂盒回收纯化；3) 将纯化的PCR产物和PET‑32(a)分别用EcoRⅠ 和HindⅢ 双酶切，酶切产物经回收纯化，用T4 DNA连接酶进行连接，得到重组表达载体PET‑32(a)‑MCP；4) 重组表达载体PET‑32(a)‑MCP转化大肠杆菌感受态细胞E.coli.BL21(DE3)，PCR筛选阳性菌株，得到重组菌株PET‑32(a)‑MCP/BL21，将PET‑32(a)‑MCP/BL21接种于LB液体培养基中，37℃ 200 r/min培养过夜；按1：100的比例接种到新鲜LB液体培养基中，37℃ 200 r/min至OD600为0.4‑0.6，加入1mM IPTG诱导表达，然后进行SDS‑PAGE分析；将诱导后的菌体进行超声破碎处理，收集处理后的上清及沉淀，分别进行SDS‑PAGE分析，以确定原核表达蛋白的表达形式；5) 重组菌株PET‑32(a)‑MCP/BL21， 分别使用不同IPTG浓度：1 mM、0.5 mM、0.1 mM、0 mM及不同诱导时间：0h、2h、4h、6h、8h进行诱导表达，以确定最佳的诱导表达条件；6) 经过诱导的重组菌株PET‑32(a)‑MCP/BL21经超声波破碎处理，离心去上清，沉淀溶解在适量的磷酸钠缓冲液中，然后参照蛋白纯化试剂盒对融合表达的重组蛋白进行纯化，经Bradford法测定并调整蛋白的浓度为250μg/ml；7) 取纯化后的重组蛋白2ml采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔，并在免疫前采集正常血清作为阴性对照，以后每2周加强免疫一次，共4次；首次免疫加入与蛋白等量的弗氏完全佐剂，后3次加入与蛋白等量的弗氏不完全佐剂，末次加强免疫7 d后，心脏采血，分离血清；抗血清经抗体亲和纯化得到纯化的多克隆抗体，浓度为3mg/ml；8) 纯化的多克隆抗体，经ELISA法测定抗体效价大于1：50000。