[发明专利]大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用

权利要求书

1.一种大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白GSIV-MCP的原核表达、多克隆抗体的制备方法，其步骤是：

1)根据GSIV-MCP基因序列，设计特异性引物：

PET-MCP-FP：5′-CGGAATTCATGTCTTCTGTAACCG-3′，含有EcoRⅠ 酶切位点；

PET-MCP-RP：5′-CCAAGCTTTTACAAGATTGGGAATC-3′，含有HindⅢ 酶切位点；

GSIV-MCP基因为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；

2) 用EPC细胞培养GSIV，病毒DNA提取试剂盒抽提病毒核酸为模板，进行PCR扩增，PCR采用50μL反应体系：10×PCR Buffer 5μL，10mmol/L dNTP 1μL，Primers：10μmol/L PET-MCP-FP和10μmol/L PET-MCP-RP各1μL，5U/μL rTaq DNA聚合酶0.5μL，DNA 模板为1μL，ddH₂O补足至50μL；PCR扩增程序为：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸10 min；PCR 产物经1.0%w/v琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR产物及胶回收试剂盒回收纯化；

3) 将纯化的PCR产物和PET-32(a)分别用EcoRⅠ 和HindⅢ 双酶切，酶切产物经回收纯化，用T4 DNA连接酶进行连接，得到重组表达载体PET-32(a)-MCP；

4) 重组表达载体PET-32(a)-MCP转化大肠杆菌感受态细胞E.coli.BL21(DE3)，PCR筛选阳性菌株，得到重组菌株PET-32(a)-MCP/BL21，将PET-32(a)-MCP/BL21接种于LB液体培养基中，37℃ 200 r/min培养过夜；按1：100的比例接种到新鲜LB液体培养基中，37℃ 200 r/min至OD₆₀₀为0.4-0.6，加入1mM IPTG诱导表达，然后进行SDS-PAGE分析；将诱导后的菌体进行超声破碎处理，收集处理后的上清及沉淀，分别进行SDS-PAGE分析，以确定原核表达蛋白的表达形式；

5) 重组菌株PET-32(a)-MCP/BL21， 分别使用不同IPTG浓度：1 mM、0.5 mM、0.1 mM、0 mM及不同诱导时间：0h、2h、4h、6h、8h进行诱导表达，以确定最佳的诱导表达条件；

6) 经过诱导的重组菌株PET-32(a)-MCP/BL21经超声波破碎处理，离心去上清，沉淀溶解在适量的磷酸钠缓冲液中，然后参照蛋白纯化试剂盒对融合表达的重组蛋白进行纯化，经Bradford法测定并调整蛋白的浓度为250μg/ml；

7) 取纯化后的重组蛋白2ml采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔，并在免疫前采集正常血清作为阴性对照，以后每2周加强免疫一次，共4次；首次免疫加入与蛋白等量的弗氏完全佐剂，后3次加入与蛋白等量的弗氏不完全佐剂，末次加强免疫7 d后，心脏采血，分离血清；抗血清经抗体亲和纯化得到纯化的多克隆抗体，浓度为3mg/ml；

8) 纯化的多克隆抗体，经ELISA法测定抗体效价大于1：50000。

2.权利要求1所述的一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白的多克隆抗体在检测GSIV中的应用。