[发明专利]大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白、多克隆抗体的制备；同时还涉及一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白、多克隆抗体的制备方法；还涉及一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白、多克隆抗体的应用。

背景技术

中国大鲵(Andrias davidianus)俗名“娃娃鱼”，是现存个体最大的两栖动物，属于两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科。中国大鲵是我国珍贵特产，属于国家二级保护动物。然而随着其养殖规模的扩大以及集约化程度的提高大鲵病害越来越严重，已经成为制约大鲵产业健康发展的一个重要因素。近年来许多大鲵养殖场暴发了大鲵病毒性出血病，该病传染性强、死亡率高达90％以上，给大鲵养殖业造成了巨大的经济损失。其病原为大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus，GSIV)，虹彩病毒的一个主要特征是具有直径为120-300nm二十面体衣壳结构，由一种分子量约50kDa的主衣壳蛋白(major capsid protein，MCP)构成，该结构蛋白占病毒蛋白总量的40％-45％(ChincharV G，2005)。虹彩病毒的主衣壳蛋白不仅是病毒的抗原相关蛋白，并且在病毒的包装和感染过程中发挥重要作用。

因此GSIV-MCP基因的原核表达、多克隆抗体的制备将为GSIV现场快速检测试剂盒的研制及大鲵病毒性出血病的防治奠定一定的基础。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白基因与PET-32(a)原核表达载体融合表达的重组蛋白，简称为PET-GSIV-MCP。大鲵彩病毒主衣壳蛋白(major capsid protein，MCP)，分子量约50kDa，占病毒蛋白总量的40％-45％(ChincharV G，2005)，是虹彩病毒的抗原相关蛋白，在病毒的包装和感染过程中发挥重要作用。本发明将MCP基因克隆到原核表达系统PET-32(a)(Novagen)中，可以方便的制备大量融合表达的重组蛋白。该重组蛋白带有6xHis Tag，便于纯化。经蛋白纯化试剂盒处理后，为一种高纯度的可溶性蛋白。该蛋白可以直接免疫实验动物进行抗血清的制备，也可以直接免疫大鲵为大鲵提供免疫保护力。MCP基因具有高度的保守性，目前本实验室已经对湖北、湖南、陕西、浙江等地的大鲵病毒进行了MCP基因的扩增及序列比对，其相互之间MCP基因核苷酸序列的同源性高达99％以上。因此GSIV-MCP基因原核表达蛋白及多克隆抗体的制备对于全国各地GSIV的检测及大鲵病毒性出血病的免疫防治提供了可能。

本发明的另一个目的是在于提供了一种重组蛋白(PET-GSIV-MCP)的多克隆抗体。该多克隆抗体经ELISA效价检测，具有滴度高，特异性强等特点。

本发明的另一个目的是在于提供了一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白、多克隆抗体的制备方法。表达蛋白经过纯化免疫新西兰大白兔，制备并纯化了PET-GSIV-MCP的多克隆抗体。经ELISA效价检测，制备的多克隆抗体具有滴度高，特异性强等特点。

本发明的再一个目的是在于提供了一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白的多克隆抗体在检测GSIV中的应用。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

以EPC细胞(武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号：CCTCCGDC0174)培养GSIV。病毒DNA提取试剂盒(OMEGA，Viral DNA Kit)抽提病毒核酸为模板，PCR扩增得到GSIV-MCP基因。将GSIV-MCP基因克隆至原核表达载体PET-32(a)(Novagen)，采用的载体PET-32(a)(Novagen)含有6个His标签，外源基因与载体融合表达，但不影响其免疫原性，因此制备的多克隆抗体特异性不受影响。重组表达载体PET-32(a)-MCP转化至感受态细胞E.coli.BL21(DE3)(Novagen)中，构建了重组菌株PET-32(a)-MCP/BL21，通过诱导表达条件(IPTG浓度、时间)的优化，PET-32(a)-MCP在E.coli.BL21(DE3)(Novagen)中得到了高效表达。融合表达的重组蛋白经过简单处理，经蛋白纯化试剂盒(Promega，HisLink Spin Protein Purification System)纯化得到了高纯度的可溶性蛋白。以此蛋白免疫新西兰大白兔，制备了PET-GSIV-MCP的抗血清，抗血清经过抗体亲和纯化，得到纯度较高的PET-GSIV-MCP的多克隆抗体。

一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白、多克隆抗体的制备方法，其步骤是：