[发明专利]山羊Myostatin基因敲除载体的构建方法

摘要

本发明公开了一种山羊Myostatin基因敲除载体的构建方法。该方法根据绵羊Myostatin基因序列，设计了两对PCR引物，以山羊胎儿成纤维细胞中提取的基因组DNA为模板，采用高保真长片段Taq酶，通过Long-PCR方法来扩增获得同源臂，同源长短臂分别为4.6kb和1.9kb。为验证所得到的同源臂序列是否可用，将扩增片段分别克隆到pMD18-T载体上，酶切、PCR鉴定后进行序列测定及同源性比较。再将同源长、短臂分别克隆到载体pLOXP，后用酶切、PCR方法进行鉴定。筛选得到构建含有neo和HSV-tk正负筛选标记基因的MNST基因打靶载体pLOXP-MSTN。本发明用Long-PCR方法等构建Myostatin基因敲除载体，并对山羊胎儿成纤维细胞进行转染，获得基因敲除细胞。运用此项技术，可以获得高瘦肉率动物，构建MNST基因敲除的山羊模型，为进一步研究该基因在山羊中的功能具有重要的意义。

主权项

一种山羊Myostatin基因敲除载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计4对引物，2对引物用于山羊胎儿成纤维细胞基因组DNA中扩增片段，即扩增出MSTN基因同源长臂的引物LAF和LAR和扩增出MSTN基因同源短臂的引物SAF和SAR；另2对引物用于鉴定pLOXP‑MSTN转染山羊胎儿成纤维细胞获得抗性克隆细胞，即用于从pLOXP‑MSTN转染山羊胎儿成纤维细胞中扩增同源短臂的引物SAF1和SAR1；用于从pLOXP‑MSTN转染山羊胎儿成纤维细胞中扩增基因neo部分序列的引物NF和NR；(2)采取分步克隆策略构建最终打靶载体；pLOXP载体包含正向选择基因neo表达元件、负向选择基因HSV‑tk表达元件以及质粒骨架；将pLOXP和pMD18‑T‑SA分别用Sa1I、BamHI双酶切，凝胶电泳回收相应的片段，其中pLOXP酶切回收约为8.0kb的载体大片段，pMD18‑T‑SA酶切回收的是约1.9kb的SA片段，用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经鉴定后得到含有重组载体pLOXP‑SA的克隆；将载体pLOXP‑SA和pMD18‑T‑LA分别用NotI、XhoI双酶切，凝胶电泳回收相应片段，其中pLOXP‑SA酶切回收约为9.9kb的载体大片段，pMD18‑T‑LA酶切回收约4.6kb的LA片段，然后用T4DNA连接酶连接，转化转化大肠杆菌DH5a感受态细胞后筛选重组子，提取质粒后经酶切鉴定最后得到山羊成纤维细胞MSTN基因打靶载体pLOXP‑MSTN；(3)将打靶载体的线性化后，转染山羊胎儿成纤维细胞系，利用含G418的培养液对转染细胞筛选5至10天后，获得抗性细胞，提取抗性细胞克隆DNA进行PCR鉴定，并进行基因序列测序以进一步验证，获得MNST基因敲 除的山羊胎儿成纤维细胞。