[发明专利]山羊Myostatin基因敲除载体的构建方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及基因敲除载体，尤其涉及一种山羊Myostatin基因敲除载体的构建方法。

[背景技术]

肌肉生长抑制素，即MSTN，也被称为“生长分化因子8”，是TGF-β超蛋白家族成员之一，具有抑制骨骼肌分化的作用。MSTN与动物骨骼肌总量的调节有关，其功能的缺失会造成骨骼肌异常肥大。在牛中，MSTN基因保守功能区的一个突变与产肉量密切相关，该突变纯合体及杂合体肉牛均表出肌肉发达、初生重增加和生长速度快的优势。采用基因打靶制备的MSTN基因敲除小鼠，其骨骼肌重量是普通小鼠的2倍以上，而脂肪比例并未随之增加，表明MSTN基因的缺失或突变将引起其骨骼肌重量的显著增加。因此，生产MSTN基因敲除山羊，可望提高山羊胴体瘦肉率，达到提高饲料利用率、降低饲养成本的目的。

基因打靶也被称为“位点特异性同源重组”或“基因敲除”，是20世纪80年代后半期兴起的一种以基因同源重组技术和胚胎干细胞技术为基础的遗传操作技术。该项技术利用外源DNA与细胞基因组DNA同源序列发生同源重组对细胞基因组进行定点修饰，可实现外源基因的定点整合，使人类定向改造生物遗传信息的期望付诸现实。目前，小鼠等啮齿动物的基因打靶技术已经比较成熟，众多学者利用基因定点敲除小鼠研究哺乳动物的基因功能。由于缺乏成熟的胚胎干细胞系，猪、牛、羊等大型哺乳动物的胚胎干细胞基因打靶一直未能实现。近年来，体细胞克隆技术的发展为基因敲除大型动物的生产提供了有效的技术支撑。若对体细胞进行基因敲除，再以靶细胞为核供体进行体细胞克隆，可获得基因敲除动物，采用此技术途径生产的的基因敲除猪、牛、羊已相继诞生。在体细胞中进行基因打靶已获得成功，但体细胞发生同源重组的机率偏低，通常只有10^-6～10^-7。已有的研究发现同源序列的同源性及同源序列的长度是影响同源重组效率的主要因素，即当载体中采用与打靶目的细胞系完全相同的同源序列时，可获得5～20倍提升的同源重组效率性；另外，当载体同源序列从4kb增加至9kb时，基因靶位操作效率增加10倍。因此，在获得同源序列时，不但要保证其具有相当的长度，还要保证其具备高度同源性。

[发明内容]

本发明要解决的技术问题是提供一种山羊Myostatin基因敲除载体的构建方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种山羊Myostatin基因敲除载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)设计4对引物，2对引物用于山羊胎儿成纤维细胞基因组DNA中扩增片段，即扩增出MSTN基因同源长臂的引物LAF和LAR和扩增出MSTN基因同源短臂的引物SAF和SAR；另2对引物用于鉴定pLOXP-MSTN转染山羊胎儿成纤维细胞获得抗性克隆细胞，即用于从pLOXP-MSTN转染山羊胎儿成纤维细胞中扩增同源短臂的引物SAF1和SAR1；用于从pLOXP-MSTN转染山羊胎儿成纤维细胞中扩增基因neo部分序列的引物NF和NR；

(2)采取分步克隆策略构建最终打靶载体；pLOXP载体包含正向选择基因neo表达元件、负向选择基因HSV-tk表达元件以及质粒骨架；将pLOXP和pMD18-T-SA分别用Sa1I、BamHI双酶切，凝胶电泳回收相应的片段，其中pLOXP酶切回收约为8.0kb的载体大片段，pMD18-T-SA酶切回收的是约1.9kb的SA片段，用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经鉴定后得到含有重组载体pLOXP-SA的克隆；将载体pLOXP-SA和pMD18-T-LA分别用NotI、XhoI双酶切，凝胶电泳回收相应片段(pLOXP-SA酶切回收约为9.9kb的载体大片段，pMD18-T-LA酶切回收约4.6kb的LA片段)后，用T4DNA连接酶连接，转化转化大肠杆菌DH5a感受态细胞后筛选重组子，提取质粒后经酶切鉴定最后得到山羊成纤维细胞MSTN基因打靶载体pLOXP-MSTN；

(3)将打靶载体的线性化后，转染山羊胎儿成纤维细胞系，利用含G418的培养液对转染细胞筛选5至10天后，获得抗性细胞，提取抗性细胞克隆DNA进行PCR鉴定，并进行基因序列测序以进一步验证，获得MNST基因敲除的山羊胎儿成纤维细胞。

本发明的有益效果是：

用Long-PCR方法等构建Myostatin基因敲除载体，并对山羊胎儿成纤维细胞进行转染，获得基因敲除细胞。运用此项技术，可以获得高瘦肉率动物，构建MNST基因敲除的山羊模型，为进一步研究该基因在山羊中的功能具有重要的意义。

[具体实施方式]

一、材料