[发明专利]一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法

摘要

本发明公开了一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法。传统方法生产的5-氨基乙酰丙酸的产量不高。本发明在重组大肠杆菌培养的一定阶段进行短暂的厌氧发酵，从而改变重组大肠杆菌的代谢行为，具体的改进措施包括：在保藏编号为CGMCC No.1939的工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA的培养过程的一定阶段，进行30～75分钟的厌氧发酵，从而改变细胞的生理状态，适当降低细胞的生长速率，促进产物5-氨基乙酰丙酸的积累。本发明在发明200710068169.0的基础上，进一步改进5-氨基乙酰丙酸的发酵生产技术，所得的胞外5-氨基乙酰丙酸产量高，适合于工业化应用，前景广阔。

主权项

1.一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法，其特征在于如下步骤：步骤(1).用接种针从保藏编号为CGMCC No.1939的工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA的甘油管中蘸取菌液后，在含有3050μg/ml卡那霉素和3050μg/ml氯霉素的LB培养基平板上划线，并将划线后的LB培养基平板放置于37℃下过夜培养；步骤(2). 将LB培养基平板上的单克隆接种于含3050ml LB培养基的250ml摇瓶中，并放置在转速为200220rpm，温度为37℃的摇床中过夜培养，得到一级种子；步骤(3). 取15ml一级种子接种于含50100ml LB培养基的500ml的摇瓶中，并放置在转速为200220rpm，温度为37℃的摇床中培养34h，得到二级种子；步骤(4). 将100300ml二级种子接种于含79 L发酵培养基的15 L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐的搅拌转速为300500rpm, 空气流量为510 L/min，起始培养温度为37℃；23h后培养温度降至2630℃，并用0.020.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导；所述的步骤(4)中的发酵培养基是由质量体积比分别为0.52%蛋白胨、0.251%酵母粉、0.31%琥珀酸、0.20.4%甘氨酸和0.10.5%葡萄糖组成，其pH值为6.06.3；发酵培养基最开始用1020%体积分数的稀硫酸，将pH控制在5.86.0；步骤(5). 当菌体生长至56小时后，将发酵罐的搅拌转速调为0，发酵液中溶氧值随之变为0，维持3075min 的厌氧发酵后恢复发酵罐的搅拌转速；所述的发酵液，在二级种子接种48h后通过反馈流加补料培养基，将发酵液的pH调为6.16.3；所述的补料培养基体积为8001100ml，且含有7090 g琥珀酸和5070 g甘氨酸；步骤(6). 当菌体密度OD₆₀₀达到310 时，分批或者连续补加5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂；所述的5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂为35g/L D-葡萄糖；所述的步骤(1)中的保藏编号为CGMCC No.1939工程菌，分类命名：中文名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为Escherichia coli Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA。