[发明专利]一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法

说明书

技术领域

    本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种通过在细菌培养的一定阶段进行短暂厌氧发酵的方法来调节重组大肠杆菌的代谢行为，从而提高发酵过程目的产物产量的发酵过程优化和调控新方法。 

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-amino1evulinic acid, ALA)是生物体内四氢吡咯类化合物（如血红素酶、卟啉和维生素B₁₂等）的共同前体，具有重要的生理活性。ALA在农业上可用做光合作用促进剂、抗逆剂、落叶剂和除草剂等，用途广泛、对环境友好。在医学领域，5-氨基乙酰丙酸作为新一代光动力学药物在脑瘤、皮肤癌等疾病的诊断和治疗方面有着极大的应用价值。 

5-氨基乙酰丙酸的生产方法可分为化学合成法和微生物发酵法。化学合成ALA有多种途径，可分别以马尿酸、琥珀酸、四氢糠胺及乙酰丙酸等为原料合成ALA，但是这些方法通常产率低、副产物多、环境污染严重。利用类球红细菌突变株和重组大肠杆菌发酵法生产5-氨基乙酰丙酸在生产成本和产品质量方面均具有显著的竞争优势。通过构建基因工程菌来生产5-氨基乙酰丙酸是一种廉价且有效的方法。专利ZL 200710068169.0中公开了一种由基因工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA来发酵生产ALA的方法，其中ALA的产量可达到6.6g/L。 

在重组大肠杆菌的发酵体系中，溶解氧浓度对细胞代谢的影响非常复杂。2003年, Antonio De León等（De León A, Hernández V, Galindo E, Ramírez OT, Enzyme Microb Technol, 2003, 33: 689-697）的研究表明，在用重组大肠杆菌研究过量表达青霉素酰基转移酶时，生长耦联型产率系数与溶解氧浓度的关系呈饱和型曲线，而非生长耦联型产率系数则在1%-5%的DOT下达到最大值。精确地控制发酵过程中的溶氧值在较低的水平可以提高目的产物的产量。但是，在工业规模精确控制发酵过程中的溶氧值的操作成本较高。大肠杆菌作为兼性有氧厌氧生物，在进行有氧发酵和厌氧发酵时，其生理和代谢有很大差异。Vemuri等（Vemuri GN, Eiteman MA, Altman E, J Ind Microbiol Biotechnol, 2002, 28: 325-332）的研究发现，与完全的好氧发酵相比，采用好氧/厌氧两阶段发酵可以大幅度提高琥珀酸的产量。在这样的两阶段发酵中，从好氧发酵到厌氧发酵的转换时机，会对大肠杆菌的代谢行为产生不可忽略的影响，从而使琥珀酸产量发生显著改变。因此，巧妙地利用这种好氧发酵和厌氧发酵间生理和代谢的变化，就有可能有目的地实现发酵过程代谢流的控制。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法，以进一步提高5-氨基乙酰丙酸的产量。 

本发明方法所采用的技术方案包括以下步骤： 

步骤(1).用接种针从保藏编号为CGMCC No.1939的工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA的甘油管中蘸取菌液后，在含有30 50μg/ml卡那霉素和3050μg/ml氯霉素的LB培养基平板上划线，并将划线后的LB培养基平板放置于37℃下过夜培养；

所述的保藏编号为CGMCC No.1939的工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2007.01.25。

步骤(2). 将LB培养基平板上的单克隆接种于含3050ml LB培养基的250ml摇瓶中，并放置在转速为200220rpm，温度为37℃的摇床中过夜培养，得到一级种子；

步骤(3).取15ml一级种子接种于含50100ml LB培养基的500ml的摇瓶中，并放置在转速为200220rpm，温度为37℃的摇床中培养34h，得到二级种子；

步骤(4).将100300ml二级种子接种于含79 L发酵培养基的15 L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐的搅拌转速为300500rpm, 空气流量为510 L/min，起始培养温度为37℃；23h后培养温度降至2630℃，并用0.020.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导；