[发明专利]一种受精卵胞质内注射DNA生产转基因水牛的方法

摘要

一种受精卵胞质内注射DNA生产转基因水牛的方法。体外成熟的水牛卵母细胞经体外受精IVF后，将携带有增强绿色荧光蛋白EGFP基因的转基因载体pEGFP-N1质粒DNA直接显微注射到水牛受精卵胞质中，制作水牛转基因胚胎，然后在倒置荧光显微镜下挑选表达EGFP的水牛转基因囊胚，移植到受体水牛子宫角中，获得转基因水牛。采用本发明的方法，成功生产了表达EGFP的水牛转基因囊胚，囊胚阳性率达到63％，胚胎移植后成功获得2头表达EGFP基因的转基因水牛。应用本发明培育转基因水牛，操作简单，成本较低，使转基因动物的培育过程大大简化，这为转基因动物的生产提供了一个重要的技术基础，具有重要的理论意义和实际意义。

主权项

一种受精卵胞质内注射DNA生产转基因水牛的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)水牛受精卵的制备：从屠宰场收集的水牛卵巢上抽取的卵母细胞经体外成熟培养24h后进行体外受精IVF，IVF后7～8h，在体视显微镜下挑选排出第二极体的受精卵，(2)受精卵胞质内注射DNA制作水牛转基因胚胎：将携带有增强绿色荧光蛋白EGFP基因的转基因载体pEGFP‑N1质粒DNA直接显微注射到IVF后7～8h的受精卵胞质中，注射的质粒DNA浓度为20μg/ml，注射量为15～30pL，注射后的水牛受精卵置于颗粒细胞单层里共培养6～7d后，在荧光显微镜下检测胚胎的EGFP表达情况，筛选获得水牛转基因胚胎，25％转基因胚胎发育至囊胚阶段，63％的囊胚表达EGFP，(3)转基因水牛的生产：将挑选出表达EGFP的水牛转基因囊胚移植到自然发情或同期发情处理的受体母水牛的子宫角中，每头母牛移植2枚胚胎，受体水牛经妊娠足月后产下2头犊牛，分别取2头犊牛耳部组织进行PCR和Southern Blot等分子生物学技术鉴定，检测到用该方法生产的水牛犊耳部组织均表达有EGFP标记基因。