[发明专利]一种受精卵胞质内注射DNA生产转基因水牛的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程的动物生物技术，特别是水牛繁殖与定向遗传改良领域。具体是一种受精卵胞质内注射DNA生产转基因水牛的方法。

背景技术

动物转基因技术(Animal Transgenic Technology)是借助基因工程技术将外源基因导入受体动物基因组内，并能稳定表达且能将导入的外源基因稳定遗传给后代的技术。其主要特点是能人为有目的地改变动物的遗传结构，而赋予转基因动物新的表型特征。

水牛是我国南方的一种极具开发前景的重要家畜，因其适应性强、耐高温高湿、抗病力强、耐粗饲、容易饲养、使用年限长和乳品营养价值高等特性，而倍受人们关注与重视。然而，目前我国水牛的品种的产奶量和繁殖率低，制约水牛奶业的发展，急需应用胚胎工程技术对其进行品种改良。转基因技术的出现，为动物的品种改良和新品种的培育提供了一条新的途径。与其他转基因技术相比，受精卵胞质内注射DNA转基因技术是将携带有外源基因的质粒DNA直接注入到受精卵的胞质中，以生产转基因动物。其具有步骤简单、容易操作，胚胎成活率高，且成本较低等优点，使转基因动物的培育过程大大简化。为此，本发明通过受精卵胞质内注射DNA技术体外生产水牛转基因胚胎，并结合胚胎移植技术建立一种生产转基因水牛的新方法。这为转基因动物的生产提供了一个重要的技术基础，具有重要的理论意义和实际意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种受精卵胞质内注射DNA生产转基因水牛的方法。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：一种受精卵胞质内注射DNA生产转基因水牛的方法，包括如下步骤：

(1)水牛受精卵的制备：从屠宰场收集的水牛卵巢上抽取的卵母细胞经体外成熟培养24h后进行体外受精(IVF)，IVF后7～8h，用吸管轻轻反复吹打使粘附于卵母细胞周围的精子脱落，再在50倍的体视显微镜下选择排出第二极体的受精卵，以进行受精卵显微注射DNA，

(2)受精卵胞质内注射DNA制作水牛转基因胚胎：将携带有增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的转基因载体(pEGFP-N1)质粒DNA通过显微注射的方法直接注入到IVF后7～8h的受精卵胞质中，注射的质粒DNA浓度为20μg/ml，注射量为15～30pL，注射后的水牛受精卵置于颗粒细胞单层共培养6～7d后，在荧光显微镜下检测发育到囊胚的EGFP表达情况，筛选获得水牛转基因胚胎，25％转基因胚胎发育至囊胚阶段，63％的囊胚表达EGFP，

(3)转基因水牛的生产：将挑选出表达EGFP的水牛转基因囊胚移植到自然发情或同期发情处理的受体母水牛的子宫角中，每头母牛移植2枚胚胎，受体水牛经妊娠足月后产下2头犊牛。分别取2头犊牛耳部组织进行PCR和Southern Blot等分子生物学技术鉴定，检测到用该方法生产的水牛犊耳部组织均表达有EGFP标记基因。

本发明的突出优点在于：

采用本发明的方法，成功生产了转基因水牛胚胎，25％转基因胚胎发育至囊胚阶段，63％的囊胚表达EGFP，经过胚胎移植后有1头受体水牛获得妊娠到期并产下2头犊牛，2头都存活，分别取2头犊牛的耳部组织进行PCR和Southern Blot等分子生物学技术鉴定，检测到用该方法生产的水牛犊耳部组织明显均表达有EGFP标记基因。

附图说明

图1是本发明获得的表达有EGFP的常光下的水牛转基因囊胚。

图2是本发明获得的表达有EGFP的荧光灯下的水牛转基因囊胚。

图3是本发明获得的转基因水牛犊耳部组织的PCR检测结果(1、Marker；2、①号转基因水牛；3、②号转基因水牛；4、阴性对照)。

图4是本发明获得的转基因水牛犊耳部组织的Southern Blot检测结果(1、①号转基因水牛；2、②号转基因水牛)。

图5是本发明获得的表达有EGFP的转基因水牛。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

本发明所述的一种受精卵胞质内注射DNA生产转基因水牛的方法，包括如下步骤：

(1)水牛受精卵的制备：