[发明专利]一种利用转基因技术获得高烷烃含量牛角瓜的方法

摘要

本发明提供一种利用转基因技术获得高烷烃含量牛角瓜的方法，属于生物技术领域。该方法通过将植物烷烃合成过程中涉及的一些关键基因构建到植物表达载体pCAMBIA1301中，得到的嵌合体DNA通过发根农杆菌的介导转化牛角瓜无菌苗的叶片，得到的毛状根经诱导分化后得到转基因牛角瓜植株。通过对获得的转基因植株进行PCR及RT-PCR分析，结合气相色谱对烷烃含量的检测，筛选出高烷烃含量的牛角瓜转基因植株，规模化繁育后进行人工种植。本发明获得的转基因牛角瓜植株烷烃含量较野生植株提高30％以上，且具有耐盐碱、耐干旱、耐瘠薄等特性，在生物能源等领域具有巨大应用潜力。

主权项

一种利用转基因技术获得高烷烃含量牛角瓜的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)烷烃合成过程关键基因的克隆；提取拟南芥总RNA并反转录产生cDNA，以cDNA为模板，根据烷烃合成过程关键基因的序列设计引物，对其进行PCR扩增，将获得的目的片段插入T载体，然后进行DNA序列分析；(2)植物表达载体的构建；将测序正确的基因用BamH I和Sac I从T载体上切下，插入植物表达载体，构建成含外源基因的植物表达载体；(3)通过发根农杆菌的介导进行植物转化；采用冻融法将含外源基因的植物表达载体导入发根农杆菌，涂布在含卡那霉素50mg/L的YEB平板上，在28℃恒温培养箱中培养2天后，挑取单菌落，用PCR方法进行检测，检测为阳性的克隆用于感染牛角瓜无菌苗的叶片；感染后的牛角瓜叶片在黑暗条件下共培养2天，然后转至含有300mg/L头孢霉素的MS培养基，25±1℃，16h/8h光/暗培养，每隔2周转接一次，共转接3‑5次，感染后约3‑4周产生毛状根，待毛状根长至2‑3cm，用PCR方法进行检测；(4)转基因植株再生；将检测为阳性的毛状根切下后转至芽诱导培养基上进行生芽培养，待获得的芽长至1‑2cm高时，将获得的再生芽转入生根培养基，经过2‑3周培养，再生芽生根长成完整再生植株；(5)转基因植株的检测和筛选；对转基因植株采取三步法筛选，第一步，采用PCR方法扩增转基因植株的目的基因，检测外源基因是否转入；第二步，对PCR检测为阳性的转基因株系进行RT‑PCR分析，判断外源基因是否在转基因植株中表达；第三步，对获得的阳性转基因植株进行烷烃含量的分析，筛选高产烷烃的转基因牛角瓜。