[发明专利]一种利用转基因技术获得高烷烃含量牛角瓜的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用转基因技术获得高烷烃含量牛角瓜的方法，属于生物技术领域。

背景技术

牛角瓜(Calotropis gigantea)属于萝藦科，直立灌木，可高达3米，全株有乳汁，幼枝被灰白色绒毛。零星分布于我国广东、广西、云南、海南等地。其乳汁可提炼树胶原料，还可制鞣料及黄色染料。茎皮纤维坚韧，可制人造棉、造纸、制绳索、织麻布和麻袋等。种毛可作丝绒原料及填充物。

牛角瓜为传统药用植物，在其分布的热带和亚热带地区有悠久的药用历史。到19世纪80年代科学家在牛角瓜中发现含有烃类成分，由此牛角瓜作为能源植物逐渐得到重视。在早期对能源植物的筛查过程中发现牛角瓜可以生产生物原油，其主要成分为碳氢化合物。如果在10000株每公顷的种植密度下，其产量可以达到6.6桶/公顷。这些生物原油经过分析已经证明是和石油主要成分相同的碳氢化合物，而且，这些物质的成分及含量并不随季节和土壤条件不同而产生明显变化。但是牛角瓜中烃类成分含量较低，无法满足工业利用的要求，因此提高牛角瓜中烷烃含量成为迫切需求。分子育种由于具有周期短、目标明确等特点，适用于高烷烃含量牛角瓜品种的培育。

目前，生物合成烷烃的代谢途径的阐明主要来自对蜡质合成的研究结果。蜡质合成的代谢途径主要包括两个不同的代谢途径：乙酰还原途径和脱羰基途径(Kunst L et al.Progress in Lipid Research，2003，42，51-80)，其中烷烃就是脱羰基途径的一个重要的中间代谢产物。经过研究已经发现一些烷烃合成的关键酶，这些酶负责脂肪酸到烷烃的转化，具体的代谢途径为脂肪酸在酰基CoA还原酶的作用下生成脂肪醛，再进一步由脂肪醛脱羰基酶催化形成烷烃。Aarts等(Aarts et al.The Plant Cell 1995，7，2115-2127)克隆了拟南芥的CER1基因，CER1主要在茎、花和果实中表达，在叶中表达水平较低。CER1蛋白与膜内在蛋白有相似性，是高度疏水性分子。因为CER1突变体中醛大量积累，而烃的含量却降低，所以推测CER1蛋白为脱羧酶，催化长链醛到烃的转化。Chen等(Chen X et al.The Plant Cell，2003，15，1170-1185)从拟南芥中克隆并鉴定了第一个能同时影响上表皮蜡质层和角质膜层组成和结构的基因WAX2，WAX2突变体与野生型相比具有以下变异：角质层较野生型轻20％但厚36％；蜡质组分总量降低78％以上；叶面水分蒸发显著增强；对除草剂的耐受力降低。通过对WAX2基因突变体的研究发现WAX2基因的突变封闭了醛类物质及其代谢物的合成，因此WAX2可能通过影响长链乙酰CoA的还原发挥作用，另外，WAX2突变体的表皮膜的瓦解现象说明WAX2可能在角质合成过程也是必须的基因。Kurata等(Kurata T et al.The Plant Journal，2003，36，55-66)随后也报道了WAX2基因(另命名为YORE-YORE)的克隆与基因表达部位的研究，WAX2(YORE-YORE)只在茎表皮分生组织和嫩叶、茎、果实和根的形成初期的细胞中有特定表达，在生长的表面毛上有高表达，WAX2(YORE-YORE)可能控制从酰基CoA向醛类和角质层组分的转化。Sturaro等(Sturaro M et al.Plant physiology，2005，138，478-489)在玉米中克隆了WAX2的同源基因命名为GLOSSY1，该基因与玉米表皮的发育及蜡质的积累有关。另外，Pierre等(Broun P et al.PNAS，2004，101，4706-4711)在拟南芥中克隆了WIN1基因，研究发现该基因为一个乙烯诱导的转录因子，一些蜡质合成过程中的关键基因例如CER1，KCS1和CER2等均受到该基因的控制，利用转基因技术使该基因在拟南芥中过量表达发现植物叶表皮蜡质的含量达到对照组的4.5倍，并且烷烃占到其中的85％高于对照组的65％。

本发明利用发根农杆菌的介导将烷烃合成过程中涉及的一些关键基因转入牛角瓜中，获得牛角瓜转基因毛状根，经过在芽诱导培养基和生根培养基中的培养，最终获得了转基因牛角瓜，检测结果表明，本发明中获得的转基因牛角瓜的烷烃含量得到了明显提高。目前尚未见到有关利用转基因技术提高牛角瓜烷烃含量的报道。

发明目的及内容