[发明专利]一种利用转基因技术获得高烷烃含量牛角瓜的方法

权利要求书

1.一种利用转基因技术获得高烷烃含量牛角瓜的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)烷烃合成过程关键基因的克隆；

提取拟南芥总RNA并反转录产生cDNA，以cDNA为模板，根据烷烃合成过程关键基因的序列设计引物，对其进行PCR扩增，将获得的目的片段插入T载体，然后进行DNA序列分析；

(2)植物表达载体的构建；

将测序正确的基因用BamH I和Sac I从T载体上切下，插入植物表达载体，构建成含外源基因的植物表达载体；

(3)通过发根农杆菌的介导进行植物转化；

采用冻融法将含外源基因的植物表达载体导入发根农杆菌，涂布在含卡那霉素50mg/L的YEB平板上，在28℃恒温培养箱中培养2天后，挑取单菌落，用PCR方法进行检测，检测为阳性的克隆用于感染牛角瓜无菌苗的叶片；感染后的牛角瓜叶片在黑暗条件下共培养2天，然后转至含有300mg/L头孢霉素的MS培养基，25±1℃，16h/8h光/暗培养，每隔2周转接一次，共转接3-5次，感染后约3-4周产生毛状根，待毛状根长至2-3cm，用PCR方法进行检测；

(4)转基因植株再生；

将检测为阳性的毛状根切下后转至芽诱导培养基上进行生芽培养，待获得的芽长至1-2cm高时，将获得的再生芽转入生根培养基，经过2-3周培养，再生芽生根长成完整再生植株；

(5)转基因植株的检测和筛选；

对转基因植株采取三步法筛选，第一步，采用PCR方法扩增转基因植株的目的基因，检测外源基因是否转入；第二步，对PCR检测为阳性的转基因株系进行RT-PCR分析，判断外源基因是否在转基因植株中表达；第三步，对获得的阳性转基因植株进行烷烃含量的分析，筛选高产烷烃的转基因牛角瓜。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)所述的烷烃合成过程关键基因为WAX2、CER1和WIN1中的一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的烷烃合成过程关键基因的克隆引物是根据Genbank中拟南芥WAX2、CER1和WIN1的mRNA序列进行设计，其序列如表1所示。

表1烷烃合成过程关键基因的克隆引物

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述的植物表达载体为pCAMBIA-1301，该载体多克隆位点的Xba I和Sal I之间插入了35S CAMV启动子，Sac I和EcoR I间插入了NOS终止子。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)所述的发根农杆菌为ATCC15834。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)所述的检测转基因发根所用的PCR引物如表1所示。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤4)所述的芽诱导培养基是MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA或MS+0.5mg/L NAA+4.0mg/L 6-BA，生根培养基为MS。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5)所述的转基因植株PCR和RT-PCR所用的引物如表1所示。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5)所述的牛角瓜转基因植株中烷烃的提取及检测方法如下：

牛角瓜转基因植株在50℃下干燥至恒重，粉碎后过40目筛，按液固比20∶1向粉碎的样品中加入正己烷，剧烈混合10min后，5000rpm离心10min进行液固分离，取上层液相到一新容器中；按上述方法重复提取两次，合并三次正己烷相，50℃减压蒸馏回收正己烷，膏状物即为烷烃物质粗提物；得到的烷烃提取物用正己烷溶解后用气相色谱进行检测；检测条件如下：

进样口：250℃，分流比40∶1

检测器：350℃

柱温：升温速率℃/分 温度℃ 保持时间(分)

            -        50        0.5

        10        350        5.0

根据样品中各烷烃色谱峰的保留时间与C₈-C₄₀ alkane window标准品中各烷烃的保留时间进行比较，确定牛角瓜转基因植株中烷烃种类；分别利用烷烃标准品建立牛角瓜转基因植株中含有的各种烷烃的标准曲线，并计算牛角瓜转基因植株中各种烷烃的含量；牛角瓜转基因植株中含有的各种烷烃的含量总和即为牛角瓜转基因植株的烷烃含量。