[发明专利]霉菌类聚酮化合物合成基因在酵母中的异源表达

摘要

本发明涉及一种表达载体的制作方法，所述方法从真核生物具有的包含内含子的基因中除去该基因所包含的内含子，仅将外显子序列连接，从而制作包含该连接的序列的表达载体。详细而言，涉及以下方法：利用PCR从包含内含子的霉菌的巨大基因中将外显子序列作为一个或多个片段扩增，利用缺口修复克隆法将该片段及经限制性酶处理的载体连接，从而制作包含连接的外显子序列的表达载体的方法；合成巨大基因的cDNA片段并连接，制作包含全长cDNA序列的表达载体的方法；导入了利用该方法制作的表达载体的转化体；由该转化体产生的蛋白质；以及得到使用该表达载体由该蛋白质产生的化合物的方法。

主权项

一种制作表达载体的方法，所述方法将真核生物具有的、包含内含子的基因或推定为基因的基因组序列的外显子序列连接，制作包含该连接成的序列的表达载体，所述方法包括以下工序：工序(a)：利用PCR，从提取自真核生物的基因组，将外显子序列作为多个片段扩增，这里，PCR中使用的正向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有：与使扩增的片段连接所得的片段的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的有义链的5’末端部分的序列互补的序列，反向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有：与使扩增的片段连接所得的片段的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的反义链的5’末端部分的序列互补的序列，通过使用这些引物，在扩增的片段的末端添加与连接在该片段上的片段的末端部分同源的序列或与载体的限制性酶处理末端部分同源的序列，及工序(b)：将通过工序(a)得到的片段和经限制性酶处理过的载体同时转化至芽殖酵母或分裂酵母，由此利用同源重组得到片段和片段、及片段和载体连接成的表达载体。