[发明专利]霉菌类聚酮化合物合成基因在酵母中的异源表达

说明书

技术领域

本发明涉及表达载体的制作方法，所述方法从真核生物具有的包含内含子的基因中除去该基因所包含的内含子，仅将外显子序列连接，从而制作包含该连接成的序列的表达载体。详细而言，涉及以下方法：利用PCR从包含内含子的霉菌的巨大基因中将外显子序列作为多个片段扩增，利用缺口修复克隆法将该片段及限制性酶处理的载体连接，从而制作包含连接成的外显子序列的表达载体的方法；合成巨大基因的cDNA片段并连接，制作包含全长cDNA序列的表达载体的方法；导入有利用该方法制作的表达载体的转化体；由该转化体产生的蛋白质；以及得到使用该表达载体由该蛋白质产生的化合物的方法。

背景技术

由霉菌的基因组序列的分析结果明确了在霉菌基因组上存在推定为二次代谢产物的生物合成基因的多个基因，但没有确认这些基因编码的蛋白质(二次代谢产物的生物合成酶)的生产。

通常，为了获得基因组序列编码的蛋白质，需要首先制备mRNA，通过逆转录酶合成cDNA后，将该cDNA导入至表达载体。通常而言，基因的阅读框巨大时，很可能不能合成完全长度的cDNA，因此，有时存在cDNA文库中不能覆盖的阅读框，另外，难以将基因导入与取得的生物不同的宿主中使其表达(异源表达)。

目前为止，二次代谢产物用作许多药品先导化合物，作为如上所述使用的二次代谢产物，例如可以举出聚酮化合物类天然产物及肽类天然产物。已知这些天然产物分别通过聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)及非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase，NRPS)被生物合成(非专利文献1-3)。

对于由霉菌基因组序列明确的、推定为二次代谢产物的生物合成基因的基因，也期待通过该基因编码的蛋白质合成的二次代谢产物的有用性。但是，由于霉菌为真核生物，所以基因中包含内含子，并且基因巨大，因此，利用如上所述的现有的方法难以合成完全长度的cDNA，不能合成推定为二次代谢产物的生物合成基因的基因编码的蛋白质。

由于上述情况，迫切需要开发出从霉菌的巨大生物合成基因中除去内含子，使该基因编码的蛋白质表达的方法。

非专利文献1：Leadlay，P.，et al.，Nature 1990

非专利文献2：Katz，L.，et al.，Science 1991

非专利文献3：SamsonS.，et al.，Nature 1985

非专利文献4：Hisao Moriya，et al.，PLos ONE 2010

发明内容

本发明的目的在于：从不能利用逆转录酶合成全长cDNA的霉菌的巨大基因中仅取出外显子序列并连接，制作包含该连接成的序列的表达载体；或者合成上述巨大基因的cDNA片段并连接，制作包含全长cDNA序列的表达载体；以及使用该表达载体使该基因编码的蛋白质表达。

为了达成上述目的，发明人等利用PCR将作为霉菌的一种的球毛壳霉(Chaetomium globosum)基因组中存在的预测为推定的生物合成基因中的外显子序列的序列扩增，使这些外显子序列和限制性酶处理过的载体通过芽殖酵母中的同源重组而连接，制作表达载体，使用以酵母作为宿主的体系使该表达载体表达。即，本发明人等为了除去基因中的内含子序列，首次利用缺口修复克隆法，从而完成了本发明。

即，本发明提供一种制作表达载体的方法，所述方法将真核生物具有的包含内含子的基因或推定为基因的基因组序列的外显子序列连接，制作包含该连接成的序列的表达载体，所述方法包括以下工序：

工序(a)：利用PCR，从提取自真核生物的基因组，将外显子序列作为多个片段扩增，