[发明专利]霉菌类聚酮化合物合成基因在酵母中的异源表达

权利要求书

1.一种制作表达载体的方法，所述方法将真核生物具有的、包含内含子的基因或推定为基因的基因组序列的外显子序列连接，制作包含该连接成的序列的表达载体，所述方法包括以下工序：

工序(a)：利用PCR，从提取自真核生物的基因组，将外显子序列作为多个片段扩增，

这里，PCR中使用的正向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有：与使扩增的片段连接所得的片段的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的有义链的5’末端部分的序列互补的序列，反向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有：与使扩增的片段连接所得的片段的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的反义链的5’末端部分的序列互补的序列，通过使用这些引物，在扩增的片段的末端添加与连接在该片段上的片段的末端部分同源的序列或与载体的限制性酶处理末端部分同源的序列，及

工序(b)：将通过工序(a)得到的片段和经限制性酶处理过的载体同时转化至芽殖酵母或分裂酵母，由此利用同源重组得到片段和片段、及片段和载体连接成的表达载体。

2.一种制作表达载体的方法，所述表达载体包含真核生物具有的、包含内含子的基因或推定为基因的基因组序列的全长cDNA序列，所述方法包括以下工序：

工序(a)：从提取自真核生物的mRNA合成cDNA片段，利用PCR扩增该cDNA片段，

这里，PCR中使用的正向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有：与使扩增的片段连接所得的片段的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的有义链的5’末端部分的序列互补的序列，反向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有：与使扩增的片段连接所得的片段的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的反义链的5’末端部分的序列互补的序列，通过使用这些引物，在扩增的片段的末端添加与连接在该片段上的片段的末端部分同源的序列或载体的限制性酶处理末端部分同源的序列，及

工序(b)：将通过工序(a)得到的cDNA片段和经限制性酶处理过的载体同时转化至芽殖酵母或分裂酵母，由此利用同源重组得到片段和片段、及片段和载体连接成的表达载体。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，真核生物为霉菌。

4.如权利要求3所述的方法，其中，霉菌为青霉属(Penicilium属)、毛壳属(Chaetomium属)、或曲霉属(Aspergillus属)。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，基因或推定为基因的基因组序列为4～20kb。

6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，基因或推定为基因的基因组序列为编码聚酮合酶或非核糖体肽合成酶的序列。

7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，被连接的序列为包含序列号15～21、29及47中的任一个表示的碱基序列的多核苷酸。

8.一种转化体，导入有通过权利要求1～7所述的方法制作的表达载体。

9.一种蛋白质，由权利要求8所述的转化体产生。

10.一种得到化合物的方法，所述方法使用通过权利要求1～7所述的方法制作的表达载体，得到由包含内含子的基因或推定为基因的基因组序列编码的蛋白质产生的化合物。

11.如权利要求10所述的方法，包括下述工序：培养导入了表达载体的转化体，从培养液或转化体中提取化合物。