[发明专利]尿足细胞特异信使核糖核酸聚合酶链反应检测方法

摘要

一种尿足细胞特异信使核糖核酸聚合酶链反应检测方法的建立，其特征在于构建步骤为：尿液标本的收集；总RNA提取及浓度纯度检测；逆转录；引物设计与合成；real-timePCR反应；标准品制备及标准曲线制作；待测样本及标准品real-time PCR反应。本发明具有快速简便的特征，且可获得优异的定量直线相关系数(R2＞0.99)。同时，所建立的方法检测浓度范围广，podocalyxin及CD2-AP分别跨10个及8个数量级，两种基因最低检测浓度所对应的Ct值分别可达35、33.2286。此外，利用该方法检测两种基因高浓度及低浓度模板Ct值的组间及批间差异均小于3％，提示该方法稳定性高，可重复性好。该方法的建立为快速、简便检测尿液足细胞特异性mRNA提供了稳定的技术平台。

主权项

一种尿足细胞特异信使核糖核酸聚合酶链反应检测方法，其特征在于构建步骤为：步骤1、尿液标本的收集：留取晨尿200‑300ml，将晨尿置于离心机上并在离心力为3000g、温度4℃下，离心30分钟，弃上清，细胞沉渣重新悬浮于1ml焦碳酸二乙酯‑PBS缓冲液(焦碳酸二乙酯与PBS缓冲液按体积比1∶1000配制)，得到悬浮液，将悬浮液置于离心机上并在离心力为12000g、温度4℃下，离心5分钟，弃上清，剩余沉渣中加入1ml RNAiso Plus，充分混匀，得到沉渣与RNAiso Plus的混合液；步骤2、总RNA提取步骤：步骤2.1将所述沉渣与RNAiso Plus的混合液置于离心机上并在离心力为12000g、温度4℃下，离心5分钟，吸取上清液，转入新的离心管；步骤2.2向由步骤2.1获得的上清液中加入200ul氯仿，盖紧离心管，剧烈振荡15秒，待溶液充分乳化且分层现象消失后，再室温静置5分钟，得到混悬液；步骤2.3将步骤2.2得到的混悬液置于离心机上并在离心力为12000g、温度4℃下，离心5分钟；步骤2.4取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中；步骤2.5向由步骤2.4得到的上清液中加入等体积异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15‑30℃下静置10分钟，得到混合液；步骤2.6将步骤2.5得到的混合液置于离心机上并在离心力为12000g、温度4℃下，离心5分钟；步骤2.7弃去上清，沿离心管壁加入体积浓度为75％的乙醇1ml，上下颠倒洗涤离心管，置于离心机上并在离心力为12000g、温度4℃下，离心5分钟后弃去乙醇，得到RNA沉淀；步骤2.8室温干燥RNA沉淀2‑5分钟，加入30ul Rnase‑free水，用移液枪吹打RNA沉淀并使其溶解，得到RNA溶液，再利用紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度；步骤3、逆转录：反应体系：1ug步骤2.8所述的RNA溶液，4ul 5X PrimeScriptTM Buffer，1ul PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I，1ul Oligo dT Primer，1ul Random 6mers，dH2O 混匀至20ul，将反应体系升温至37℃，反应15分，再继续升温至85℃，反应5秒，逆转录生成的cDNA置于‑20℃保存；步骤4、引物设计与合成：podocalyxin：forward 5’‑CTTGAGACACAGACACAGAG，reverse 5’‑CCGTATGCCGCACTTATC；CD2‑AP：forward 5’‑AGGCTGGTGGAGTGGAAC，，reverse 5’‑CAGAGAAGGTATAGGTGAAGTAGG；β‑actin：forward 5’‑TGGCACCCAGCACAATGAA，reverse 5’‑CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA；步骤5、实时荧光定量PCR反应：PCR反应体系：2ul由步骤3得到的cDNA，10ul SYBR Premix Ex TaqTM，0.4ul正义引物，0.4ul反义引物，0.4ul ROX Reference dye  以及6.8ul dH2O，采用两步法进行PCR扩增：①将PCR反应体系加热至95℃，反应30s，②在95℃下反应5s后降温至60℃反应31s，并以95℃下反应5s后降温至60℃反应31s为一个循环，如此扩增40个循环，最后建立溶解曲线(dissociation curve，DC)并鉴定产物特异性；步骤6、准标准品制备及准标准曲线制作：将步骤5获得的反应产物进行10倍梯度稀释后得到不同浓度的准标准品，将不同浓度的准标准品作为模板分别加入PCR反应体系进行PCR扩增，用准标准品浓度和Ct值制作准标准曲线；步骤7、如果准标准曲线的线性相关系数大于0.99，则将准标准品作为标准品，并进入8，否则，返回步骤6，步骤8、将待检测尿液进行步骤1～3的处理，得到待测cDNA，再分别对待测cDNA和步骤7得到的标准品进行步骤5所述的实时荧光定量PCR反应，制作标准曲线并根据标准曲线计算待测cDNA中各基因的含量，并与待测cDNA内参基因含量进行校正，最终得出各基因表达量。