[发明专利]尿足细胞特异信使核糖核酸聚合酶链反应检测方法

说明书

技术领域

本发明属于糖尿病肾病尿液生物标志物研究方法的建立，特别涉及一种基于SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的尿液足细胞特异性信使核糖核酸(mRNA)检测技术的构建。

背景技术

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)在西方发达国家是导致终末期肾衰(end-stage renal disease，ESRD)的首要病因。在我国，DN也是仅次于肾小球疾病而导致ESRD的第二位病因。DN的发病机制目前尚未完全阐明。足细胞是一类附着于肾小球基底膜上的高度分化的上皮细胞，参与维持滤过屏障的完整性。最近大量研究证实，足细胞损伤在DN发病及进展过程中发挥极为重要的作用。足突融合、足细胞肥大、凋亡、脱落，以及足细胞上皮间充质转分化都是可能参与DN发展的机制。因此，检测足细胞特异性表达的蛋白及基因已成为研究DN的一种方法。

目前，肾穿刺以及免疫组化技术是研究足细胞标志分子的常规方法，然而肾穿刺作为一项创伤性检查，具有穿刺后出血、感染等不可避免的操作风险，且无法对患者进行连续动态观察。因此，需求无创、动态监测患者足细胞特异分子表达改变的技术成为研究热点。

实施荧光定量PCR(real-time quantitive PCR)作为一项成熟可靠的技术以其高灵敏度、高特异性及稳定性而广发用于各项分子生物学研究。尿液中蕴藏着大量生物学信息且具有无创收集、标本处理相对简便的优势，而目前尚无基于real-time PCR技术检测尿液足细胞特异性mRNA方法构建的报道。

发明内容

本发明提供一种基于SYBR GREEN I实时荧光定量PCR技术的尿足细胞特异信使核糖核酸聚合酶链反应检测方法。

本发明利用SYBR GREEN I实时荧光定量PCR技术，建立尿液足细胞相关mRNA(podocalyxin、CD2-AP)的检测方法，评估其检测范围及稳定性。

本发明技术解决方案如下：

一种尿足细胞特异信使核糖核酸聚合酶链反应检测方法，构建步骤为：步骤1、尿液标本的收集：留取晨尿200-300ml，将晨尿置于离心机上并在离心力为3000g、温度4℃下，离心30分钟，弃上清，细胞沉渣重新悬浮于1ml焦碳酸二乙酯-PBS缓冲液(焦碳酸二乙酯与PBS缓冲液按体积比1∶1000配制)，得到悬浮液，将悬浮液置于离心机上并在离心力为12000g、温度4℃下，离心5分钟，弃上清，剩余沉渣中加入1ml RNAiso Plus，充分混匀，得到沉渣与RNAiso Plus的混合液；步骤2、总RNA提取步骤：步骤2.1将所述沉渣与RNAiso Plus的混合液置于离心机上并在离心力为12000g、温度4℃下，离心5分钟，吸取上清液，转入新的离心管；步骤2.2向由步骤2.1获得的上清液中加入200ul氯仿，盖紧离心管，剧烈振荡15秒，待溶液充分乳化且分层现象消失后，再室温静置5分钟，得到混悬液；步骤2.3将步骤2.2得到的混悬液置于离心机上并在离心力为12000g、温度4℃下，离心5分钟；步骤2.4取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中；步骤2.5向由步骤2.4得到的上清液中加入等体积异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15-30℃下静置10分钟，得到混合液；步骤2.6将步骤2.5得到的混合液置于离心机上并在离心力为12000g、温度4℃下，离心5分钟；步骤2.7弃去上清，沿离心管壁加入体积浓度为75％的乙醇1ml，上下颠倒洗涤离心管，置于离心机上并在离心力为12000g、温度4℃下，离心5分钟后弃去乙醇，得到RNA沉淀；步骤2.8室温干燥RNA沉淀2-5分钟，加入30ul Rnase-free水，用移液枪吹打RNA沉淀并使其溶解，得到RNA溶液，再利用紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度；步骤3、逆转录：反应体系：1ug步骤2.8所述的RNA溶液，4ul 5X PrimeScriptTM Buffer，1ul PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I，1ul Oligo dT Primer，1ul Random 6mers，dH2O混匀至20ul，将反应体系升温至37℃，反应15分，再继续升温至85℃，反应5秒，逆转录生成的cDNA置于-20℃保存；步骤4、引物设计与合成：podocalyxin：forward 5’-CTTGAGACACAGACACAGAG，reverse 5’-CCGTATGCCGCACTTATC；CD2-AP：forward 5’-AGGCTGGTGGAGTGGAAC，，reverse 5’-CAGAGAAGGTATAGGTGAAGTAGG；β-actin：forward 5’-TGGCACCCAGCACAATGAA，reverse 5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA；步骤5、实时荧光定量PCR反应：PCR反应体系：2ul由步骤3得到的cDNA，10ul SYBR Premix Ex TaqTM，0.4ul正义引物，0.4ul反义引物，0.4ul ROX Reference dye  以及6.8ul dH2O，采用两步法进行PCR扩增：①将PCR反应体系加热至95℃，反应30s，②在95℃下反应5s后降温至60℃反应31s，并以95℃下反应5s后降温至60℃反应31s为一个循环，如此扩增40个循环，最后建立熔解曲线(dissociation curve，DC)并鉴定产物特异性；步骤6、准标准品制备及准标准曲线制作：将步骤5获得的反应产物进行10倍梯度稀释后得到不同浓度的准标准品，将不同浓度的准标准品作为模板分别加入PCR反应体系进行PCR扩增，用准标准品浓度和Ct值制作准标准曲线；步骤7、如果准标准曲线的线性相关系数大于0.99，则将准标准品作为标准品，并进入8，否则，返回步骤6；步骤8、将待检测尿液进行步骤1～3的处理，得到待测cDNA，再分别对待测cDNA和步骤7得到的标准品进行步骤5所述的实时荧光定量PCR反应，制作标准曲线并根据标准曲线计算待测cDNA中各基因的含量，并与待测cDNA内参基因含量进行校正，最终得出各基因表达量。