[发明专利]一种甲型流感病毒甄别与耐药检测基因芯片的制备和用途

摘要

本发明涉及一种流感病毒甄别与耐药检测基因芯片，其制备方法包括制备通用引物，制备亚型核酸分型探针及耐药探针，制备寡核苷酸芯片，建立RT-PCR体系，建立杂交体系。利用本发明制备的基因芯片可同时甄别5种亚型的甲型流感病毒，包括甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3N2、禽H5N1、猪H1N1流感病毒，并可提示甲型流感病毒达菲耐药情况。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为流感病毒的监测、临床诊断及治疗提供指导。

主权项

1.一种检测甲型流感病毒核酸亚型和耐药性的基因芯片，其制备方法包括：1)步骤一：制备3对通用引物，序列如表1所示：表1引物序列2)步骤二：制备10条流感亚型核酸分型探针，序列如表2所示：表2流感亚型核酸分型探针序列制备6条耐药检测探针，序列如表3所示：表3耐药检测探针序列3)步骤三：将步骤二中的各个寡核苷酸探针用6×SSC，0.1％SDS稀释至终浓度50μM，并点到空白的醛基化修饰玻片上，阵列如表4所示，其中片基质控探针为20T序列，5’端cy3标记、3’端NH2修饰；阴性探针为与病毒无关的植物基因序列；通用序列为甲型流感病毒保守序列；引物1、2、3分别为引物NR21、NR22和NF5的反向互补序列，每条序列3’端NH₂修饰，所有探针的点样量均为3nl，使用前至少在室温放置干燥18小时；表4寡核苷酸探针阵列  片基质控  引物1  引物2  引物3  通用序列  阴性探针  阴性探针  片基质控  NEW-1  NEW-2  H1N1-1  H1N1-2  H3N2-1  H3N2-2  AIV-1  AIV-2  NEW-1  NEW-2  H1N1-1  H1N1-2  H3N2-1  H3N2-2  A1V-1  A1V-2  NEW-1  NEW-2  H1N1-1  H1N1-2  H3N2-1  H3N2-2  AIV-1  AIV-2  OSE-1  OSE-2  OSE-3  OSE-4  OSE-5  OSE-6  SIV-1  SIV-2  OSE-1  OSE-2  OSE-3  OSE-4  OSE-5  OSE-6  SIV-1  SIV-2  OSE-1  OSE-2  OSE-3  OSE-4  OSE-5  OSE-6  SIV-1  SIV-2  片基质控  阴性探针  阴性探针  通用序列  引物3  引物2  引物1  片基质控4)步骤四：制备RT-PCR体系，配方如表5所示：表5R TPCR体系配方5)步骤五：制备杂交液，其组成为4×SSC，0.3％SDS，5％甲酰胺，16μM 20T-NH₂；制备洗液A，其组成为1×SSC，0.2％SDS；制备洗液B，其组成为0.2×SSC；制备洗液C，其组成为0.1×SSC。