[发明专利]人抗凝血酶Ⅲ基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法

摘要

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用基因打靶技术，使人抗凝血酶III基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法。本法构建的基因打靶载体，通过同源重组将人源性抗凝血酶III基因定点整合入崂山奶山羊胎儿成纤维细胞株基因组上某一确定的位点，克服了随机整合的盲目性和危险性，并且基因打靶载体的表达量高于转基因的表达量(大约高2～10倍)；在人源性抗凝血III基因的后面加上牛生长激素基因的poly(A)信号，有助于基因打靶载体在第一代克隆崂山奶山羊的乳腺中表达人抗凝血酶III基因；本基因打靶载体中有两个相同方向的lox序列，便于将来工作中除去筛选基因，以最终使人抗凝血酶III基因在崂山奶山羊体内高效表达。

主权项

人抗凝血酶III基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法，该方法包括以下步骤：功能基因的获得；基因打靶载体的构建和标记基因的接入；转化受体细胞经筛选获得阳性细胞株；阳性细胞株DNA制备；阳性细胞株经核移植，获得含有人抗凝血酶III基因的克隆崂山奶山羊和转基因奶山羊的鉴定；其特征是：(1)功能基因的获得从人肝脏组织中获得人抗凝血酶III基因的mRNA，逆转录成cDNA；通过PCR方法建立两端的连接酶切位点；PCR产物连接在pUC19质粒上，再进行DNA序列分析；(2)基因打靶载体的构建和标记基因的接入以崂山奶山羊β‑酪蛋白基因为基因打靶载体，分别将人抗凝血酶III基因，lox序列，poly(A)信号，新霉素抗性筛选基因(neo)和lox序列依次构建到β‑酪蛋白基因为表达框架中；(3)转化受体细胞经筛选获得阳性细胞株转化受体细胞后，经筛选获得基因打靶阳性细胞株；(4)阳性细胞株DNA制备培养的细胞转入含有蛋白酶K的DNA裂解液中，用Pst I酶消化，在0.8％的凝胶上进行电泳，然后将DNA转入纤维膜中，分别用P32标记探针杂交；(5)阳性细胞株核移植经供核细胞的培养，核移植和胚胎移植，获得含有人抗凝血酶III基因的转基因崂山奶山羊；(6)转基因奶山羊的鉴定提取奶山羊组织DNA，通过PCR或Southern分析，进行转基因奶山羊的鉴定。