[发明专利]人抗凝血酶Ⅲ基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用基因打靶技术，使人抗凝血酶III基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法。

背景技术

随着转基因动物的问世，基因工程制药愈来愈受到人们的认可和关注，转基因技术不但可以加快畜种改良力度，提高畜产品产量和质量，而且可以生产珍贵药用蛋白，为人类造福。转基因动物最诱人的前景是作为生物反应器，利用它生产人类所需的生物活性产品或药物。而乳腺生物反应器是目前生产外源蛋白最有效的生物反应器，也是目前国际上惟一证明可以达到商业化生产水平的生物反应器(朱小甫，2007)。1987年，Gordon等将组织纤溶酶原激活剂(tPA)与小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的启动子构成重组基因，成功培育出能在乳汁中表达tPA的转基因小鼠，开启了利用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白的时代(Gordon K，1987)。

外源基因在动物乳腺中高效表达的关键是整合到动物染色体组中的表达载体(调控序列和外源基因)要处于一个开放和活跃转录的状态。常用的乳腺生物反应器的表达载体分为普通质粒的表达载体、人工染色体的表达载体和基因打靶表达载体。其中，基于普通质粒的外源基因随机整合到宿主基因组中，往往产生位置效应，影响外源基因的高效表达；而人工染色体尚存在克隆片段不稳定、易发生缺失等难以避免的缺陷。基因打靶载体由基因打靶技术衍生而来，基因打靶技术(Gene targeting technology)是20世纪80年代后半期兴起的，按预期方式精细改造生物遗传信息的研究技术手段。是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术。它克服了随机整合的盲目性和危险性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法(孙振红，2010)。

PPL公司的McCrearh等在Nature上报道了COL1A1(原胶原)基因在胎儿成纤维细胞内进行基因打靶，在COL1A1基因内插入了IRES和无启动子的neo和α1-Antitrypsin(AAT)基因，生产出转基因克隆绵羊，羊乳中AAT蛋白含量高达650mg/L，这是第一例通过核移植生产的体细胞基因打靶克隆绵羊(McCreath，2000)。2006年Lai等(Lai，2006)制备出能够合成多不饱和脂肪酸的猪。2008年Baldassarre等(Baldassarre，2008)报道，重组人丁酰胆碱酯酶(rBChE)在哺乳期山羊乳中的表达量可达到1～5g/L，这充分些证实了利用基因打靶技术制备动物乳腺生物反应器广阔的产业化前景。

理论上，各种重组蛋白都可以通过乳腺生物反应器途径获得，其中包括一些相当复杂的蛋白分子，但可能由于转基因动物研究理论不足，转基因技术支撑体系不够完善，致使目前转基因动物成功率和成活率极低，这是限制转基因动物发展的主要因素。世界范围内，目前利用乳腺生物反应器可进行商业生产的药用蛋白仅有十余种，仍有大量的转基因药用蛋白处在研究阶段(刘静，2009)。

人抗凝血酶III是存在于血浆中的一类重要的抗凝血因子，是抗凝血酶活性的主要承担者，在临床上，可预防和治疗急、慢性血栓、血塞形成，对治疗抗凝血酶缺失症有显著疗效。目前市场上有从人体血浆中直接提取的人抗凝血酶III的蛋白注射针剂，也有用细胞和酵母作为表达载体，在体外合成的重组人抗凝血酶III蛋白，但成本高，表达量低，生产费用昂贵。2006年6月，美国GTC公司研制成功世界上第一个利用转基因乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物——重组人抗凝血酶III(商品名为Atryn，治疗先天性抗凝血酶缺乏症)，其上市许可申请获得了欧洲医药评价署人用医药产品委员会肯定的批准意见，充分证明利用哺乳动物乳腺生物反应器生产重组人抗凝血酶III具有理想的市场价值(王庆忠，2005)，但是GTC公司采用原核注射法获得转基因动物乳腺生物反应器，投入高、效率低；2008年，青岛森淼实业有限公司成功构建了分泌人抗凝血酶III的转基因山羊(邹贤刚等，2008)，并申请了专利(CN1840187A)，但鲜见利用基因打靶技术来获得携带抗凝血酶III基因的奶山羊乳腺生物反应器。