[发明专利]一种利用显微授精技术生产转基因兔的方法

摘要

一种利用显微授精技术生产转基因兔的方法，通过假阴道法采集精液或从附睾收集的精液用PBS上游，经离心洗涤后，分装到冷冻管中，投入液氮中保存；进行显微操作之前，从液氮中取出装有精子的冷冻管，室温下解冻，加入外源DNA质粒与冻融的精子充分混匀，使DNA质粒的终浓度为30ng/ul，并置于4℃下孵育10分钟，使精子与DNA充分结合，然后，通过显微授精技术，将孵育了DNA的精子注入到兔卵母细胞胞质中，显微授精后的卵母细胞经过化学激活处理后，放入培养滴中培养2-4天。用本发明的方法，成功生产了转基因兔胚胎，胚胎阳性率达到59.65％，经胚胎移植获得母兔妊娠并产下活仔兔，仔兔经过细胞和分子生物学鉴定，证明4只表达有外源基因转基因兔，阳性率为57.14％。

主权项

一种利用显微授精技术生产转基因兔的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)精液的采集和保存：通过假阴道法采集的家兔精液或者从家兔附睾里收集的精液，用磷酸缓冲液PBS上游半小时后，于2500rpm离心5分钟进行洗涤，重复洗涤三次，再用PBS液稀释浓度为1x106个精子/毫升，分装到冷冻管，直接投入液氮中保存，(2)精子与外源DNA的孵育：将装有精子的冷冻管从液氮中取出，室温下解冻，加入浓度为100ng/ul的外源DNA质粒与冻融的精子充分混匀，使DNA质粒的终浓度为30ng/ul，置于4℃条件下孵育10分钟，使精子与DNA充分结合，获得孵育了DNA的精子，(3)显微授精转基因兔的制备：将获得的孵育了DNA的精子通过显微授精技术注入到兔卵母细胞胞质中，显微授精后的卵母细胞经离子霉素(Ion)和二甲氨基嘌呤(6‑DMAP)联合放线菌酮(CHX)进行激活处理后，放入培养滴中培养2‑4天，将获得的显微授精胚胎在荧光显微镜下检测GFP表达情况，筛选出有GFP表达的显微授精转基因胚胎，并移植给受体母兔。