[发明专利]团头鲂微卫星家系鉴定方法

摘要

本发明属于鱼的育种技术领域，涉及分子标记技术领域。本发明具体涉及一种利用微卫星标记准确鉴定团头鲂混养家系的方法。其步骤包括：①采用人工繁殖的方法繁育团头鲂家系，54个家系子代混合放养在同一池塘；②采用荧光标记引物和巢式PCR扩增法分析亲本在12个微卫星位点的基因型，筛选出适合家系鉴定的有效微卫星；③分析混养家系子代在有效微卫星位点的基因型；④鉴定各子代的亲本来源。本发明首次在团头鲂上建立了亲子鉴定的方法，其鉴定准确率达到了98.4％。通过家系的筛选和鉴定，可以减少在团头鲂群体选育中存在的近亲繁殖现象，更有利于实现家系选育，从而加快选育的进程，提高选育效果。

主权项

一种团头鲂微卫星家系鉴定方法，其特征包括如下步骤：1)将来自天然群体的团头鲂亲本进行人工繁殖，得到至少50个家系，待鱼苗孵出10天后，从每个家系中随机选取200尾鱼苗混合放入池塘中，作为用于亲子鉴定的家系群体；2)选取步骤1)的团头鲂繁殖亲本的鳍条组织，提取基因组DNA，以DNA为模板，选用12对微卫星引物，对TTF01，TTF02，TTF03，TTF04，TTF05，TTF06，TTF08，TTF09，MAC31，MAC46，MAC50，MAC53共12个微卫星位点进行巢式PCR扩增；3)步骤2)所述的巢式PCR扩增方法中PCR反应体系内包含3个引物：位点特异性正向引物，其5’末端加有M13通用序列；位点特异性反向引物；FAM、NED、HEX三种荧光标记的M13通用引物；PCR反应体系为6μL：50ng DNA，3μL JumpStart Red Mix(购自Sigma公司)，1.5pmol反向引物和1.5pmol的荧光标记通用引物，0.1pmol的含加尾序列的正向引物，100μM的亚精胺；4)团头鲂繁殖亲本在12个微卫星位点的PCR产物经ABI 3730基因分析仪根据荧光标记进行基因型分析，使用P‑LOCI软件模拟分析，筛选出适合鉴定团头鲂混养家系的有效微卫星位点9个TTF01，TTF02，TTF03，TTF04，TTF05，TTF08，MAC31，MAC46，MAC50；5)将团头鲂子代混养1年后，随即选取182尾个体，剪取各个体的鳍条组织，提取个体基因组DNA，选取步骤4)中的9个有效微卫星位点，分析各子代的基因型；6)根据亲本和子代在9个微卫星位点的基因型，对不同家系进行区分，鉴定子代个体的父母本；其中步骤2)所述的12对微卫星引物的核苷酸序列如下所示：TTF01‑F：CAGTCGGGCGTCATCATGGAGATGAAAGCTGAAGGAA(5’‑3’)，R：ATGCACGAACTGCCACATAA(5’‑3’)；TTF02‑F：CAGTCGGGCGTCATCAAAACAGCTGCTACCCTTGGA(5’‑3’，)R：TTTGCCAGAAGAGCAAATCA(5’‑3’)；TTF03‑F：CAGTCGGGCGTCATCAAAGACGCCACGGAAACTTTA(5’‑3’)，R：CTGACCGGATAGCAAAGTGA(5’‑3’)；TTF04‑F：CAGTCGGGCGTCATCAGACTGGAGTCGTCAGGCTTC(5’‑3’)，R：TGCCCCACATTGTTAGACTG(5’‑3’)；TTF05‑F：CAGTCGGGCGTCATCACTAGTGGGTAGGTGGCAGGT(5’‑3’)，R：TGACTGGGAGAGACAGAGGAG(5’‑3’)；TTF06‑F：CAGTCGGGCGTCATCAGGCAGGTCAGGCACATTTAT(5’‑3’)R：TCTCTACCTCACATTCTCTCATTCT(5’‑3’)；TTF08‑F：CAGTCGGGCGTCATCAGGGGAAATAAAGGGAGAAAGTG(5’‑3’)R：TTTCTCCTGATCCGTTGACC(5’‑3’)；TTF09‑F：CAGTCGGGCGTCATCAAAGACGCCACGGAAACTTTA(5’‑3’)，R：GAGGTGGGACTGTGTGGAAT(5’‑3’)；MAC31‑F：CAGTCGGGCGTCATCAGCATCGGTAACAGTCAAA(5’‑3’)，R：CAGGGATAATGTAGGAAGAA(5’‑3’)；MAC46‑F：CAGTCGGGCGTCATCATACAAGAGCAGGTAAGCA(5’‑3’)，R：CAGCCACTGACTGAACAT(5’‑3’)；MAC50‑F：CAGTCGGGCGTCATCAGGTATCGTGCTTGCTTGT(5’‑3’)，R：TTCCATTTAGAGCTACGG(5’‑3’)；MAC53‑F：CAGTCGGGCGTCATCAAGCGGGTCTGTGCTAATC(5’‑3’)，R：CGGCCAGTTCCAAAGAGT(5’‑3’)；步骤3)所述通用引物M13的核苷酸序列如下：M13：5’‑CAGTCGGGCGTCATCA‑3’。