[发明专利]团头鲂微卫星家系鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及鱼育种和分子标记技术技术领域，具体涉及一种利用微卫星标记鉴定团头鲂混养家系子代亲本的方法。

背景技术

团头鲂(Megalobrama amblycephala Yih，1955)，又名武昌鱼，隶属于硬骨鱼纲，鲤形目，鲤科，鲂属，其自然分布仅局限于长江中下游少数几个湖泊中。团头鲂是我国重要的草食性经济鱼类之一，由于其食性广、成本低、生长快、成活率高、易捕捞，能在池塘中产卵繁殖，凡具有味美、头小、含肉率高、体形好、规格适中等优点，因而被作为优良的草食性鱼类品种在全国普遍推广。

近年来，团头鲂成为市场畅销品种，养殖经济效益较好。因而市场对团头鲂优良苗种的需求十分迫切，亟待规范团头鲂的苗种繁育生产，加快团头鲂的种质资源保护和良种选育进程。由于团头鲂苗种生产中普遍存在近亲繁殖的现象，导致种质退化加剧，常规苗种的生长速度较慢，不仅影响了团头鲂的生长性能，而且在一定程度上制约了团头鲂在更大范围的推广。虽然我国已经选育出生长较快的浦江一号，但苗种仍不能满足市场需求。还有待进一步加强团头鲂种质资源监测、评估与保护，挖掘和创新种质资源，选育出生长快、抗逆性好的团头鲂优良品种。

在鱼类遗传育种中，准确的系谱记录对于育种计划的制定具有关键性作用。由于鱼类所处的环境特点以及繁育过程中自然交配、混合受精等原因，常常造成个体系谱不明确。对于鱼类来说，为了保持家系信息，对不同的家系实施分池养殖存在所需水体大、管理强度大的缺陷，同时，大大限制了家系的数目，不利于得出正确的估计值，更重要的是，不同的环境因素影响了不同家系的性状，使育种相关的遗传参数估计产生偏差，不利于育种计划的制定(Gjederm 2005)；在混合养殖群体中保持家系信息，在鱼类上应用的传统的物理标记方法有剪鳍、烙印、体外标、编码金属标、被动整合雷达标、荧光染料、电子芯片等。其中一些标记在家畜上应用较广泛也有良好的效果，如烙印法。但是对水产动物尤其是鱼类来说，由于其所处的水体环境及鱼体自身的特点，使用物理标记存在操作繁琐、易损伤鱼体、对生长造成一定影响、标记保存时间不长等缺陷。而且，物理标记不适用于仔鱼或幼鱼，因此，在育种时首先需要对各家系分池养殖，待到可以进行物理标记时才能实施混养。这样不仅增加了养殖成本，更重要的是引入了环境误差。因此，对于鱼类个体标识、家系鉴定一直是难以解决的问题，这在很大程度上限制了良种选育工作的开展。

微卫星标记具有多态性高、稳定性强、特异性高、共显性遗传等优点，为水产动物选育中保持家系信息、确认亲缘关系、追踪系谱提供了有用的工具。如果已知父母的基因型，微卫星标记能在没有外部物理标记且不需要分开养殖的情况下区分出混养群体中个体所属的家系。有关研究(Vandeputte et al.2004；Jerry et al.2006；董世瑞等2008；Wang et al.2009)证实了微卫星在水产动物研究中确认父母本和分析家系关系中的应用价值。目前尚未见将微卫星标记应用于团头鲂家系鉴定的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用微卫星标记的多态性鉴定团头鲂家系，为团头鲂遗传育种提供必要的分子分子标记。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用微卫星标记的多态性鉴定团头鲂家系的方法，其步骤包括：

1)将来自天然群体的团头鲂亲本进行人工繁殖，得到至少50个家系，待鱼苗孵出10天后，从每个家系中随机选取200尾鱼苗混合放入池塘中，作为用于亲子鉴定的家系群体；

2)选取步骤1)的团头鲂繁殖亲本的鳍条组织，提取基因组DNA，以DNA为模板，选用12对微卫星引物，对TTF01，TTF02，TTF03，TTF04，TTF05，TTF06，TTF08，TTF09，MAC31，MAC46，MAC50，MAC53共12个微卫星位点进行巢式PCR扩增；

3)步骤2)所述的巢式PCR扩增方法指PCR反应体系内包含3个引物：位点特异性正向引物，其5’末端加有M13通用序列(5’-CAGTCGGGCGTCATCA-3’)；位点特异性反向引物；FAM、NED、HEX三种荧光标记的M13通用引物。PCR反应体系为6μL：50ng DNA，3μL JumpStart Red Mix(购自Sigma公司)，1.5pmol反向引物和1.5pmol的荧光标记通用引物，0.1pmol的含加尾序列的正向引物，100μM的亚精胺；