[发明专利]一种艰难梭菌A毒素的类毒素的制备方法

摘要

本发明公开了一种艰难梭菌A毒素的类毒素的制备方法。其步骤分为：将艰难梭菌产毒菌株经透析培养，50％饱和硫酸胺盐析，用10mmol/L醋酸盐缓冲液(pH5.5)酸沉淀，再经DEAE-Toyopearl 650M阴离子离子交换层析，再次酸沉淀。纯化的A毒素加入甲醛溶液至终浓度为0.1％-0.4％(体积比)，37℃放置7-14天，脱毒，最终制品即为艰难梭菌A毒素的类毒素。应用本发明纯化艰难梭菌A毒素，操作简单、方便、快速、易于推广，适合于实验室及大规模艰难梭菌A毒素的类毒素。本方法对艰难梭菌感染诊断试剂、疫苗研制提供了方法和手段。

主权项

一种艰难梭菌A毒素的类毒素的制备方法，包含：①艰难梭菌的透析袋产毒培养；②产毒培养液经低温离心及除菌；③硫酸铵盐析；④样品的浓缩透析；⑤第一次酸沉淀；⑥阴离子交换层析；⑦第二次酸沉淀，⑧类毒素的制备，其特征在于：上述的③.硫酸铵盐析将②除菌滤液加入饱和硫酸铵或固体硫酸铵，使最终硫酸铵的饱和浓度达到50％。4℃放置过夜，离心收集沉淀；⑤.第一次酸沉淀将④浓缩后的样品装入透析袋，用pH为pH5.4‑5.6的醋酸盐缓冲液，4℃透析24小时以上、中间换液3次，离心收集沉淀；⑥阴离子交换层析沉淀物溶于pH为7.5Tris‑HCl缓冲液，并使用同样缓冲液4℃透析24小时，中间换液3次，离心收集上清液；将其加入DEAE‑Toyopearl650M离子交换柱，先用50mmol/L pH为7.5，含50mmol/L NaCl的300ml Tris‑HCl缓冲液洗脱，再用50mmol/L、pH为7.5，含50mmol/L～250mmol/L NaCl的Tris‑HCl缓冲液梯度洗脱，按A280吸收峰收集洗脱样品；⑦第二次酸沉淀将洗脱后的样品装入透析袋，用pH为5.4‑5.6醋酸盐缓冲液，4℃透析24小时以上、中间换液3次，离心收集沉淀即为纯化的艰难梭菌A毒素；⑧.艰难梭菌A毒素的类毒素的制备纯化的A毒素加入已经甲醛溶液至终浓度为0.1％‑0.4％，37℃放置7‑14天脱毒，最终制品即为艰难梭菌A毒素的类毒素。