[发明专利]反转录-环介导等温扩增检测猪流行性腹泻的方法

摘要

本发明提供一种反转录-环介导等温扩增检测猪流行性腹泻的方法。根据PEDV N蛋白保守区域基因，设计针对靶基因上6个区域的3对引物，合成两条RT-PCR引物，使用RT-LAMP技术鉴定PED病毒；RT-PCR反应；获得的RNA进行反转录；获得的cDNA用于PCR反应；确保了扩增的特异性，扩增速度快，可在30～60min内获得结果，无需电泳实现肉眼观察扩增效果。使用酶混合物，可在恒温65℃情况下，1h内实现反转录和核酸扩增，RT-LAMP的检测是在LAMP扩增DNA的基础上，加入了反转录酶而实现扩增检测RNA，反转录和扩增一步完成，省去了传统RT-PCR要先进行的反转录步骤。

主权项

1.一种反转录-环介导等温扩增检测猪流行性腹泻的方法，其特征在于：步骤如下：步骤一：设计引物：根据PEDV N蛋白保守区域基因，设计针对靶基因上6个区域的3对引物：FIP、BIP、F3、B3、F-loop、B-loop；合成两条RT-PCR引物：PED1、PED2，模板及引物序列如下：AATCCAGGGCCACTTCGAAGGAACGTGACCTCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAATTCCCAAGGGCGAAAATAGCGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCAGAGGGGGCTTCAAAAACTTTGGAGATGCGGAATTTGTCGAAAAAGGTGTTGATGCGTCAGGCTATGCTCAGATCGCCAGTTTAGC步骤二：病毒的制备：状态良好的Vero细胞接种于6孔板，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞长满单层后，弃去培养液，用PBS洗涤一次，加入PED病毒液500μl/孔，含无EDTA胰酶40μg/ml，37℃孵育1小时，每孔补加DMEM 2.5ml，含无EDTA胰酶40μg/ml，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待80％以上细胞产生病变时取出培养板，冻融3次，收集病毒液用于RNA提取；步骤三：RNA的提取：取3ml PED病毒液，3000rpm离心10分钟去细胞碎片，上清转移至新离心管中，加入等体积预冷的PEG8000，颠倒混匀，室温放置30min或4℃放置过夜，12000rpm离心5min，弃去上清，沉淀用100μlDEPC水重悬，使用RNA抽提试剂盒提取总RNA；步骤四：RT-LAMP反应：RT-LAMP反应体系  FIP、BIP  各4μl  F3、B3  各0.5μl  F-loop、B-loop  各2μl  dNTPs(10mM)  1.5μl  Bst DNA polymerase  1μl  10×ThermoPol  2.5μl  M-MuLV  1μl  RNA  1μl  H₂O  补至25μl65℃恒温水浴1小时，85℃10min终止反应，产物于2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，阴性对照用灭菌水代替RNA模板；步骤五：RT-PCR反应：步骤三获得的RNA进行反转录，获得的cDNA用于PCR反应，反转录体系及条件如下：PCR反应体系  2×HG PCR buffer  12.5μl  dNTPs(2.5mM)  2.5μl  PED1  0.5μl  PED2  0.5μl  cDNA  1μl  super Taq DNA Polymerase  0.5μl  H₂O  补至25μl反应条件：95℃5min，94℃8s，47℃8s，72℃10s，72℃2min，30个循环，PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。