[发明专利]一种研究大曲细菌群落结构多样性的方法

摘要

本发明涉及一种研究大曲细菌群落结构多样性的方法，即梯度变性凝胶电泳(DGGE)技术，属于微生物生态技术领域，主要步骤如下：1)：直接提取大曲基因组DNA；2)：选择细菌通用引物，扩增细菌核糖体DNA中的特异性DNA片段；3)：DGGE电泳分离PCR产物；4)：切胶回收DGGE指纹图谱中微生物对应的条带；5)：重新PCR，将产物连接至T载体，蓝白斑筛选并进行阳性克隆验证；6)：测序获得DGGE条带对应微生物的种属信息。本发明是不依赖于传统培养方法的分子生物学技术，具有灵敏、方便、准确的特点，解决了对某些不能或难以培养的微生物进行研究的难题，为鉴定大曲细菌群落结构、发现新的酿酒微生物或功能微生物提供了技术依据。

主权项

一种研究大曲细菌群落结构多样性的方法，其特征在于包含以下步骤：a)选择用于分析的大曲样品；b)称取一定量的大曲样品，酶法提取基因组DNA；c)选择对大多数细菌和古细菌的16S rRNA基因V3区具有特异性的引物对F338gc和R518引物对，并在引物对正向引物一端加上GC发夹结构，引物对的序列为：F338gc：(5′‑CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG‑3′，下划线部分为发夹结构)，R518：(5′‑ATTACCGCGGCTGCTGG‑3′)；d)以步骤b)中提取的基因组DNA为模板，以步骤c)中的引物对为引物进行PCR扩增，PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测；e)将步骤d)中得到的PCR反应产物用DGGE电泳设备进行分离，电泳仪器采用Bio‑Rad公司基因突变检测系统(DcodeTM Universal Mutation Detection System)；电泳条件为电压100V，60℃电泳15h，丙烯酰胺浓度为8％，变性剂梯度为40％～60％，100％变性剂由7mol/L的尿素和质量浓度为40％的去离子甲酰胺组成；f)电泳结束后使用EB(溴化乙锭)对凝胶进行染色后脱色，在凝胶成像系统中拍照并保存图像；g)对DGGE图谱中优势微生物代表的条带进行切胶回收：将条带在紫外灯下用无菌手术刀切下，放入无菌离心管中，轻轻捣碎，加入200μL无菌双蒸水于4℃冰箱静置过夜；h)切胶条带重新PCR扩增经胶回收试剂盒纯化后连接T载体、转化大肠杆菌进行蓝白斑筛选，对筛选到的白色菌落进行阳性克隆验证；i)确认为阳性克隆后，将克隆转接至LB液体培养基中37℃培养过夜后送交测序公司测序；j)序列返回后，登陆GENEBANK进行序列比对。