[发明专利]大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30 K的RNAi植物表达载体

摘要

本发明涉及大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30 K的RNAi植物表达载体的构建，属于分子生物学领域。分别设计引物扩增Gly m Bd 30 K干扰片段和内含子片段连接pMD19-T载体，转化TOP10。在两端引入酶切位点，将三个片段[30k-antisense(A)、intron(I)和30k-sense(S)]连接起来，将A-I-S结构连入pCAMBIA1301形成干扰载体pCAScil-1301。该RNAi植物表达载体转化大豆将会对过敏蛋白质基因进行基因沉默，为确保过敏人群安全食用大豆奠定坚实基础。对提高我国大豆分子育种的技术水平具有重要理论和实践意义。

主权项

大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30K的RNAi植物表达载体的构建。1)Gly m Bd 30K干扰片段的克隆：选用‘南农32’作为材料，取幼嫩籽粒，按照TakaRa公司的Total RNA提取试剂盒说明书提取豆粒总RNA，取2μg总RNA合成cDNA，用RNase消化cDNA产物，设计引物：Ps：CCTTGTGTTGCTTCTTTTCTCC，Pa：GATGGTCACAAGAATATTGTTC，扩增Gly m Bd 30K干扰片段，Gly m Bd 30K干扰片段长395bp，进行常规聚合酶链式PCR反应，以提取的cDNA为模板，扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，51.8℃复性30sec，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min，将PCR产物连接到pMD19 T载体上，转化TOP10细胞，进行序列测定后续实验中备用；2)内含子片段的克隆：设计引物：Is：GTAAATTTCTAGTTTTTCTCCT，Ia：CTGTAACTATCATCATCATCAT，扩增内含子片段，内含子片段长190bp，进行常规PCR反应，pCAMBIA1301质粒为模板，扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，45.3℃复性30sec，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min，将PCR产物连接到pMD19 T载体上，转化TOP10细胞，进行序列测定后续实验中备用；3)Gly m Bd 30K干扰载体的构建：通过融合PCR的方法将三个片段正义基因A、内含子I及反义基因S三个片段的融合连接起来，设计四条引物：P1：acCACGTGGATGGTCACAAGAATATTGTTCCTTCP2：ACTAGAAATTTACCCTTGTGTTGP3：GAAGCAACACAAGGCTGTAACTATCAP4：tatGGTGACCGATGGTCACAAGAATATTGTTC两端引入酶切位点BstE II和PmI I，载体PMD A I S和pCAMBIA1301双酶切Bst EII/PmI I，将A I S结构连入pCAMBIA1301形成干扰载体pCAScil 1301，Bst EII/PmI I双酶切反应：5μL Buffer 1，0.5μL BSA，15μL质粒，1μL PmI I补水至50μL，37℃反应2h；酶切结束后，再加入1μL Bst E II，60℃反反应1h；转入TOP10后进行PCR和酶切验证，构建成功大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30K的RNAi植物表达载体。