[发明专利]一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法

摘要

一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，属于生物技术领域。其包括以下步骤：1)设计bar基因PCR引物，PCR扩增得到bar基因；2)构建重组质粒pET30a(+)-bar；3)构建工程菌BL21/pET30a(+)-bar；4)发酵培养，获得特异性表达蛋白；5)特异性表达蛋白进行增加可溶性处理；6)分离纯化膦丝菌素乙酞转移酶粗制品；7)保存。本发明设计合理，通过本发明可以快速得到大量、高纯度、可溶的重组膦丝菌素乙酞转移酶，该酶可作为抗原用以制备单克隆抗体，用于进行含膦丝菌素乙酞转移酶转基因产品的定性、定量检测，为有效抗原筛选、诊断试剂的开发以及转基因作物安全性评价奠定基础。

主权项

一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征包括以下工艺步骤：1)设计bar基因PCR引物，上游引物bar1核苷酸序列如SEQ No.1所示，下游引物bar2核苷酸序列如SEQ No.2所示，采用引物bar1和bar2，以质粒pDsBar 1300为模板进行PCR扩增，获得bar基因全长序列，bar基因全长序列如SEQ No.3所示；2)将得到的bar基因定向克隆到含有T7启动子的原核表达载体pET30a(+)中，构建重组质粒pET30a(+)-bar；3)将构建的重组质粒pET30a(+)-bar转入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中，构建工程菌BL21/pET30a(+)-bar；4)将工程菌BL21/pET30a(+)-bar发酵培养，诱导融合蛋白表达，使工程菌内获得特异性表达蛋白；5)将得到的特异性表达蛋白进行增加可溶性处理，然后进行分离提取，得到膦丝菌素乙酞转移酶粗制品；6)将膦丝菌素乙酞转移酶粗制品进行分离纯化，即得到膦丝菌素乙酞转移酶纯品；7)纯品经透析、冷冻干燥后，置于-70℃超低温冰箱中保存。