[发明专利]一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法

摘要

本发明涉及一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法，反义千年桐VeFAD2基因构建在表达载体pBI121质粒上，以pBI121为基本骨架，将千年桐VeFAD2基因反向连接在该载体上，采用农杆菌介导法将VeFAD2基因反向转入少根根霉后，可以改变脂肪酸成分提高油酸含量。该方法的步骤如下：(1)含酶切位点千年桐VeFAD2基因cDNA编码区全长序列获得；(2)VeFAD2反义表达载体构建；(3)农杆菌转化子的获得；(4)少根根霉工程菌株的获得。本发明有益的效果是：本发明将从千年桐种子总RNA中分离的VeFAD2基因构建到表达载体pBI121上，并采用农杆菌介导法将VeFAD2基因反向导入少根根霉，使植物脂肪酸合成基因在酵母中高效表达，提高了油脂中油酸的含量。

主权项

一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法，其特征是：在丝状真菌基因组中含有千年桐VeFAD2基因表达盒，该表达盒依次含有CaMV35S启动子、千年桐VeFAD2序列、终止密码子，所述的丝状真菌是少根根霉；该方法的步骤如下：(1)、含酶切位点千年桐VeFAD2基因cDNA编码区全长序列获得根据千年桐VeFAD2基因核苷酸序列设计引物，以千年桐未成熟种子总RNA为模板，经RT‑PCR扩增，在VeFAD2上游引入Xbal I酶切位点，下游引入BamH I酶切位点，电泳回收VeFAD2基因cDNA片段，克隆到pGEM T‑Easy载体，转化大肠杆菌DH5α，测序，命名该载体为pGEM‑T‑Vefad2；(2)、VeFAD2反义表达载体构建结合表达载体pBI121的限制性酶切位点图谱，选用Xbal I和BamH I两个位置来作为插入目的片段的酶切位点，设计带Xbal I和BamH I酶切位点的引物，以克隆载体质粒pGEM‑T‑XBfad2为模板进行PCR反应；将扩增产物与表达载体pCAM2300一起均用Xbal I和BamH I双酶切；分别回收相应的片段，用T4DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH 5α感受态细胞。提取质粒进行酶切鉴定。表达载体命名为pBI‑fad2；(3)农杆菌转化子的获得采用冻溶法将重组表达载体pBI‑fad2农杆菌菌株EHA105、AGL‑1；(4)少根根霉转化子的获得采用农杆菌介导法将VeFAD2反向导入少根根霉基因组，获得了转千年桐VeFAD2基因的少根根霉工程菌株。