[发明专利]一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，属于基因工程菌株构建方法，具体涉及一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法。

背景技术

为应对愈演愈烈的石油危机，世界各国都在积极制定和实施新的能源发展战略，希望通过各种可能途径寻找到新的石油替代品，生物柴油便是其中之一。目前，生产生物柴油的原料主要依赖于油料作物、木本油料人工林、动物脂肪及废弃油脂等。从油料树木中提取油脂，具有占用耕地面积、周期长、成本高等一系列制约因素。发展动物油脂也同样面临一系列制约因素。因此，开辟新的植物源油脂生产途径，特别是工业化生产途径对满足不断增长的生物柴油的需求具有重要意义。

研究发现，除高等植物和动物能生产油脂外，低等的微生物也能产生油脂，大部分微生物油脂的脂肪酸组成和一般植物油相似。通常情况下微生物细胞仅含油2～3％，但在适宜条件下，某些微生物产生并贮存的油脂占其生物总量的20％以上，在已知细菌、酵母、霉菌和藻类中都发现有产油脂的菌株。霉菌即丝状真菌以菌丝的方式繁殖很快，利用丝状真菌作为生物反应器生产脂肪酸，为生物柴油原料生产开辟了一条新的技术途径。丝状真菌生产油脂时，具有增殖快，生长周期短，适合工厂化生产，投入较少，收获稳定，不受季节、气候等环境条件影响，且不消耗化学肥料和农药，因而对环境污染减轻。但目前丝状真菌存在产油率低，油脂成分组成复杂，与生产优质生物柴油的原料要求仍为较大距离。运用分子生物学技术，将植物脂肪酸合成相关基因特别是控制产脂量和脂肪酸品质的基因导入丝状真菌中，构建优质“基因工程菌株”，使植物脂肪酸合成酶基因在真菌细胞中的高效表达，增加真菌产脂量，提高和控制脂肪酸组成。此种新方式可从根本上解决真菌产脂菌油质差、产油率低的缺陷，又可充分发挥丝状真菌适合于生物反应器发酵以及林源优质脂肪酸合成酶的优点。

Δ12脂肪酸脱饱和酶(又称油酸脱氢酶，简称FAD₂)是脱饱和反应中的关键酶之一，它催化油酸18∶1(Δ9)脱氢形成亚油酸18∶2(Δ9，12)，在碳链中引入第2个双键。我国南方广泛分布的生物质能源树种千年桐(Vernicia Montana)具有脂肪酸合成效率高的特性，本实验室已从千年桐发育中的种子中克隆到VeSAD₂基因，将千年桐VeSAD₂基因反向导入酵母基因组可以抑制酵母自身VeSAD₂基因的表达，从而降低酵母油脂中亚油酸的含量，为酵母产油符合生物柴油的质量要求奠定基础。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法，反义千年桐VeFAD₂基因构建在表达载体pBI121质粒上，以pBI121为基本骨架，将千年桐VeFAD₂基因反向连接在该载体上，其构建过程如图1。采用农杆菌介导法将VeFAD₂基因反向转入少根根霉后，可以改变脂肪酸成分提高油酸含量，该菌株的名称为Rhizopus arrhizusVeFAD2-1，保存在中国林业科学研究院亚热带林业研究所观赏植物研究组实验室。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法，在丝状真菌基因组中含有千年桐VeFAD₂基因表达盒，该表达盒依次含有CaMV35S启动子、千年桐VeFAD₂序列、终止密码子，所述的丝状真菌是少根根霉；该方法的步骤如下：

(1)、含酶切位点千年桐VeFAD₂基因cDNA编码区全长序列获得

根据千年桐VeFAD₂基因(GenBank登录号为EF152993)核苷酸序列设计引物，以千年桐未成熟种子总RNA为模板，经RT-PCR扩增，在VeFAD₂上游引入Xbal I酶切位点，下游引入BamH I酶切位点，电泳回收VeFAD₂基因cDNA片段，克隆到pGEM T-Easy载体，转化大肠杆菌DH5α，测序，命名该载体为pGEM-T-Vefad2；

(2)、VeFAD₂反义表达载体构建