[发明专利]一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法

权利要求书

1.一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法，其特征是：在丝状真菌基因组中含有千年桐VeFAD₂基因表达盒，该表达盒依次含有CaMV35S启动子、千年桐VeFAD₂序列、终止密码子，所述的丝状真菌是少根根霉；该方法的步骤如下：

(1)、含酶切位点千年桐VeFAD₂基因cDNA编码区全长序列获得

根据千年桐VeFAD₂基因核苷酸序列设计引物，以千年桐未成熟种子总RNA为模板，经RT-PCR扩增，在VeFAD₂上游引入Xbal I酶切位点，下游引入BamH I酶切位点，电泳回收VeFAD₂基因cDNA片段，克隆到pGEM T-Easy载体，转化大肠杆菌DH5α，测序，命名该载体为pGEM-T-Vefad2；

(2)、VeFAD₂反义表达载体构建

结合表达载体pBI121的限制性酶切位点图谱，选用Xbal I和BamH I两个位置来作为插入目的片段的酶切位点，设计带Xbal I和BamH I酶切位点的引物，以克隆载体质粒pGEM-T-XBfad2为模板进行PCR反应；将扩增产物与表达载体pCAM2300一起均用Xbal I和BamH I双酶切；分别回收相应的片段，用T₄DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH 5α感受态细胞。提取质粒进行酶切鉴定。表达载体命名为pBI-fad2；

(3)农杆菌转化子的获得

采用冻溶法将重组表达载体pBI-fad2农杆菌菌株EHA105、AGL-1；

(4)少根根霉转化子的获得

采用农杆菌介导法将VeFAD₂反向导入少根根霉基因组，获得了转千年桐VeFAD₂基因的少根根霉工程菌株。

2.根据权利要求1所述的高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法，其特征是：PCR扩增VeFAD2基因含酶切位点cDNA编码区全长，根据在GenBank上登录的VeFAD₂基因核苷酸和氨基酸序列设计兼并引物，引物序列如下：

Vefad2FP：ATA GGA TCC ATG GGT GCT GGT

Vefad2RP：GCG TCT AGA TCA GAA CTT CCA

其中Vefad2FP含酶切位点Xbal I，Vefad2 RP含酶切位点BamH I，以合成的cDNA为模板，PCR扩增千年桐VeSAD₂基因cDNA编码区；扩增条件为：94℃预变性4min，94℃30S、54℃30S、72℃1min，30个循环，72℃延伸10min；扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

3.根据权利要求1所述的高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法，其特征是：所述的千年桐VeFAD₂基因的产油酵母表达载体pBI-fad2反向插入了千年桐VeFAD₂基因。