[发明专利]利用fAFLP标记技术分析贝类遗传多样性的方法

摘要

一种利用fAFLP标记技术分析贝类遗传多样性的方法，依次经过贝类DNA提取，限制性内切酶消化DNA，对酶切后的DNA进行接头连接，PCR预扩增和选择性扩增，产物检测及图像和数据的采集和分析。与现有技术相比，本发明的优点在于：采用fAFLP标记技术结合自创的反应体系，可对贝类遗传多样性进行高效、稳定、准确地分析，另外，本方法具有扩增位点多，多态位点比例高，Nei基因多样性大的优点。

主权项

一种利用fAFLP标记技术分析贝类遗传多样性的方法，依次经过贝类DNA提取，限制性内切酶消化DNA，对酶切后的DNA进行接头连接，PCR预扩增和选择性扩增，产物检测及图像和数据的采集和分析，其特征在于所述的PCR预扩增和选择性扩增包括如下步骤：a、DNA片段的预扩增：取5μL连接完成的DNA样品，加入：50ng/μL的Mse I引物1.5μL，50ng/μL的EcoR I引物1.5μL，10×PCR Buffer 5.0μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，2.5mM d NTP 4.0μL，加水至50μL，混匀后，在如下PCR条件扩增：94℃预变性2min，94℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸60S，20个循环，引物带有一个碱基，为M00+C，预扩增完成后，在1％琼脂糖胶中检测预扩增的效果；预扩增引物为：E01：5′‑GACTGCGTACCAATTCA‑3′；M02：5′‑GATGAGTCCTGAGTAAC‑3′；b、AFLP的选择性扩增：荧光引物是在EcoR I引物的5′端加了荧光标记，用多对引物组合对各个体进行了选择性扩增，取5μL稀释的预扩增混合液，加入：50ng/μL的EcoR I引物1μL，50ng/μL的Mse I引物1μL，2.5mM dNTP 1.6μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，10×PCR Buffer 2.0μL，加H2O至20μL，PCR扩增：94℃预变性2min，94℃变性30S，65℃退火30S，72℃延伸60S，进行12个循环，每个循环退火温度降低0.7℃，至56℃；94℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸60S，进行8个循环，扩增完成后，取5μL在1％琼脂糖胶中检测扩增效果，扩增后的样品中加入15μL变性Buffer，混合，95℃变性5min后，立刻冷却到4℃。