[发明专利]一种牛新孢子虫病的检测方法及应用

摘要

本发明公开一种牛新孢子虫病检测方法，通过采用在PCR反应体系中加入指示假阴性的扩增内标，通过碱基重排、引物设计和搭桥法PCR扩增，构建了一条内标模板，并构建了含有内标的荧光定量PCR反应体系，确定了共扩增体系的反应条件，Mg2+2.5mmol/L，dNTP各0.3mmol/L，引物各0.5mmol/L，探针各0.2mmol/L，扩增条件为50℃，2min，1个循环；95℃，5min，1个循环；95℃15s，57℃45s，45个循环。本发明检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校正假阴性结果的发生，广泛应用于及时准确有效的检测牛新孢子虫病领域。

主权项

一种牛新孢子虫病检测方法，其特征在于，所述的检测方法具体步骤如下：(1)根据犬新孢子虫N.caninum Nc-5基因序列设计扩增出138bp的特异性引物Np2、Nr2和NTpro荧光探针，构建模板引物Np1和Nr1，其中Np1、Nr1位于Np2、Nr2外侧，扩增出长度为338bp的片段；将探针NTpro序列进行重排，设计引物Nc1和Nc2，通过搭桥法PCR扩增，构建了内标探针NCpro；(2)以犬新孢子虫全基因组DNA为模板，用Np1、Nr1为扩增引物，反应条件为：94℃变性5min；94℃ 30s，62℃ 20s，72℃ 30s，35个循环；最后在72℃延伸10min；扩增产物经凝胶纯化回收，连接到pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定后，构建质粒NT；(3)以质粒NT为模板，分别采用引物Np1、Nc1和Nc2、Nr1为配对引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，62℃ 20s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min，获得扩增产物Np1c1、Nc2r1；将扩增产物Np1c1、Nc2r1纯化回收，等量混合后作为模板，用引物Np1和Nr1进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min；94℃ 30S，62℃ 20s，72℃ 30s，35个循环；最后在72℃延伸10min；将扩增后的产物纯化回收并连接到pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定，构建质粒NC；(4)以质粒NT和NC为模板，以Np2、Nr2、NTpro和NCpro为引物和探针进行扩增，dNTP用量为0.3mmol/L，上下游引物用量各0.5mmol/L，两种探针用量0.2mmol/L，Mg2+用量为0.2mmol/L，TaqDNA聚合酶用量为1.5u，被检样品DNA模板1μL，NC模板100拷贝，Tm为60℃，循环参数为45个循环。