[发明专利]一种牛新孢子虫病的检测方法及应用

说明书

发明领域

本发明属于动物疫病检测领域，具体涉及原虫寄生虫病的检测方法，特别是涉及一种牛新孢子虫病的检测方法及应用领域。

背景技术

牛新孢子虫病(Neosporosis)是由犬新孢子虫(Neospora caninum)寄生在宿主体内引起的一种原虫病。该病可垂直传播，是导致奶牛流产的主要病因之一，给畜牧业造成了很大的经济损失。该病世界范围内分布广泛。从2001年以来，先后在北京、山西、青海、河北、新疆等地区的奶牛(牦牛)血清中检出了犬新孢子虫抗体的存在。迄今为止，还没有防治此病的有效药物和疫苗，因此，良好的检测技术是有效控制本病的良好方法。

目前较为常用的检测方法有间接荧光抗体试验(IFAT)、免疫组织化学检测法(IHC)、亲和素-生物素-过氧化物酶染色法(ABC)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳胶凝集试验(NAT)和免疫印迹法(IB)等，传统方法在牛新孢子虫病的防治中发挥了重要作用，但存在着一些实验操作复杂，检测周期长，不能检出潜伏感染和早期感染的患病动物等弊端。随着分子生物学技术的迅速发展，荧光PCR检测技术的应用极大的提高了检测效率和检测灵敏度。但由于样品中存在大量复杂的未知成分，以及样品处理过程中，一些物质的残留会影响PCR扩增，使反应测得的灵敏度降低甚至造成假阴性结果，对于荧光PCR检测，无法正确确定目的基因的拷贝数。通过添加内标共扩增模板的方法对检测结果进行质量控制已得到广泛的认可。

经检索，国内外也未见采用搭桥法PCR扩增构建了内标共扩增模板和荧光探针，构建了检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校准假阴性结果，提高准确率的检测牛新孢子虫病的荧光定量PCR方法的报道。因此，探索和研究检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校正假阴性结果的方法，对于及时准确有效的检测牛新孢子虫病，保护畜牧业健康发展、促进我国农产品出口和保护我国在国际贸易中的良好形象等方面均具有重要意义。

发明内容

针对目前未见有关检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校正假阴性结果，提高准确率的检测牛新孢子虫病的方法。本发明提供了一种对牛新孢子虫病灵敏、高效、快速、准确检测的方法。

本发明的目的在于提供了一种检测灵敏度高、特异性好、试验周期短，且能够指示并校正假阴性结果，确保PCR检测准确性的牛新孢子虫病检测方法。

本发明通过引物和探针设计，用搭桥法PCR扩增，获得了N.caninum荧光定量PCR扩增内标模板，并对内标模板的添加量和反应条件进行了优化，建立了含有内标物的荧光定量PCR检测体系，从而实现对牛新孢子虫病的灵敏、高效、快速、准确检测。

本发明具体提供了一种牛新孢子虫病确证和准确定量的快速检测方法。

本发明的技术方案：通过采用在PCR反应体系中加入指示假阴性的扩增内标(internal amplification control，IAC)，通过碱基重排、引物设计和搭桥法PCR扩增，构建了一条IAC片段，经条件优化，成功的构建了含有内标的荧光定量PCR反应体系，可以显示抑制成分的存在或指示假阴性的发生，实现对试验过程实施监测，确保检测质量，从而建立了一种牛新孢子虫病的检测方法。

本发明进一步提供了一种牛新孢子虫病检测方法，具体步骤如下：

1.引物和探针的设计与合成：

根据N.caninum Nc-5基因序列设计扩增出138bp的特异性引物Np2和Nr2两条，NTpro荧光探针一条，模板构建引物Np1和Nr1两条，其中Np1、Nr1位于Np2、Nr2外侧，扩增出长度为338bp的片段。将探针NTpro序列进行重排，利用碱基突变原理，设计引物Nc1和Nc2，通过搭桥法PCR扩增，构建了内标探针NCpro。

2.目标DNA模板的制备：

牛抗凝全血或牛流产胎儿组织病料按照常规报道的全血基因组DNA提取试剂盒或组织样品中基因组DNA提取试剂盒进行操作，以犬新孢子虫全基因组DNA为模板，Np1、Nr1为扩增引物，反应条件为：94℃变性5min；94℃30s，62℃20s，72℃30s，35个循环；最后在72℃延伸10min。扩增产物经凝胶纯化回收，连接到pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定后，获得目标模板pMD18-NT，本发明简称NT。

3.搭桥法PCR扩增和内标探针的设计：