[发明专利]一种发根农杆菌介导茶树发根高频诱导与遗传转化的方法

摘要

本发明涉及一种发根农杆菌介导茶树发根高频诱导与遗传转化的方法，将自行选育的抗酚发根农杆菌菌株的单菌落，在含卡那霉素的YEB培养液中培养得经活化的菌液；选用含多酚类含量在25％以下的的茶树品种的器官作为外植体，对外植体进行微伤预处理；对微伤预处理后的外植体在经活化的菌液中浸染；将浸染过的外植体经过共培养和脱菌培养获得茶树发根。本发明使发根农杆菌介导茶树进行遗传转化的发根频率从国内外研究的30％左右提高到近60％。这为发根农杆菌介导的遗传转化应用于茶树品种改良以及利用茶树发根培养生物合成儿茶素等次生代谢产物提供了一条有效途径。

主权项

一种发根农杆菌介导茶树发根高频诱导与遗传转化的方法，将自行选育的抗酚发根农杆菌菌株的单菌落，在含卡那霉素的YEB培养液中培养得经活化的菌液；选用含多酚类含量在25％以下的的茶树品种的器官作为外植体，对外植体进行微伤预处理；对微伤预处理后的外植体在经活化的菌液中浸染；将浸染过的外植体经过共培养和脱菌培养获得茶树发根；所述自行选育的抗酚发根农杆菌菌株通过下法得到：将发根农杆菌菌株(Agrobacterium rhizogenes)转接到含卡那霉素的YEB液体培养基进行菌种活化，然后将此活化菌液100μl涂布在含有茶多酚浓度为25-800μg/ml以及含卡那霉素的AB固体培养基上进行抑菌培养24-48小时，挑取在200μg/ml茶多酚浓度下仍能生长的单菌落，再转接到含200μg/ml浓度茶多酚的含卡那霉素的AB液体培养基进行菌种活化，然后将活化的菌液100μl分别涂布到含200、400、800和1000μg/ml浓度的茶多酚的含卡那霉素的AB液体培养基的平板进行再次抗酚筛选和活化培养，依此进行2-3次抗酚筛选直至获得在800-1000μg/ml浓度茶多酚培养基仍然能生长形成菌落的抗酚性强的发根农杆菌菌株。