[发明专利]一种改进的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测方法

摘要

本发明提供一种改进的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测方法，根据RSD病原细菌Lxx 16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列设计了一对特异引物Lxx1/Lxx2，用改进法提取蔗汁总DNA后，采用PCR扩增的方法，检测甘蔗宿根矮化病菌；该方法克服了现有检测技术中的缺点，提供了一种快速、稳定、准确、高灵敏度、特异性强的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测方法。

主权项

1、一种改进的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)引物设计：根据已报道的RSD病原细菌Lxx 16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列设计了一对特异引物Lxx1/Lxx2，扩增的目的片段大小为438bp，引物序列如下Lxx1：5′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′，Lxx2：5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3；2)样品蔗汁采集：每个样本随机取6条蔗茎，每条蔗茎截取中下部茎节，用砍刀切成7cm左右长，再用钳子挤压25ml左右的甘蔗汁于50ml离心管内混匀，放于-20℃冰箱保存待用，每取一个样品后砍刀和钳子均要用清水冲洗后再用70％的酒精消毒；3)蔗汁总DNA提取：(1)蔗汁DNA提取前，每一样品取2000ul蔗汁放入离心管中，12000rpm超速离心机上离心10min，弃上清，沉淀加入300ul灭菌去离子水稀释；(2)蔗汁DNA提取时，加入600ul经65″C预热的2％CTAB抽提缓冲液，65℃水浴1hr，期间每隔20min摇匀一次；(3)加入600ul氯仿/异戊醇(24∶1)剧烈振荡30S，12000rpm超速离心机上离心10min；(4)取上清液700ul置于新的1.5ml离心管中，加入等体积氯仿∶异戊醇＝24∶1，混匀，12000rpm超速离心机上离心10min；(5)取上清液650ul置于新的1.5ml离心管中，加入455ul的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱中沉淀4小时；(6)4℃下12000rpm超速离心机上离心10min，弃上清；(7)沉淀分别用400ul冷70％乙醇和冷无水乙醇各洗一次，室温下风干；(8)沉淀用30ul灭菌去离子水稀释溶解-20″C保存备用；4)PCR扩增在PCR管中按序加入以下试剂：ddH2O 8.6ul2×PCR Taq mix 8ulLxx1(20umol/L) 0.2ulLxx2(20umol/L) 0.2ulDNA模板 3.0ul加完后短速离心10秒后放进PCR仪，95℃预变性5mi，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸5min，4℃保存；5)电泳检测：取10ul PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶检测，胶里预先加入0.5％的0.5ug/ml溴化乙锭，在0.5×TBE和140V的电压下电泳20min后，用BIO-RAD凝胶成像系统观察；在感染甘蔗宿根矮化病的甘蔗样品中扩增到438bp的条带。