[发明专利]葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法及基因分型的检测方法

摘要

本发明公开了一种葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法及基因分型的检测方法，葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法步骤：1)样品处理；2)DNA提取；3)PCR；4)PCR扩增产物分析，扩增后的样品在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，如果扩增的核酸条带与表2中扩增长度一致，则可判断被检测样品是含有相应葡萄球菌肠毒素基因型的阳性样品；第一个方法可快速检测特定葡萄球菌肠毒素基因型，具有高敏感、高特异性和高准确性，第二个方法可对不同分离来源的葡萄球菌肠毒素基因进行系统分型，并为分析各毒素型间的关系提供技术支持。在食品安全检疫、疾病诊断、分子流行病学研究上具有重要意义。

主权项

一种葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法，其特征是由下述步骤组成：1)样品处理：取0.1～0.5ml样品，10000～12000r/min，离心1～2分钟；2)DNA提取：弃上清，加入400～700μl灭菌水悬浮沉淀，10000～12000r/min离心30秒～1分钟；弃上清，加入100～300μl试剂A于35～40℃下作用20～30分钟，加入试剂B，再于45～55℃下作用20～30分钟，10000～12000r/min，离心8～10分钟；取上清并加入等体积的三羟甲基氨基甲烷饱和酚，充分振荡混匀，10000～12000r/min，离心5～10分钟；取上清并加入等体积的体积比为25∶24∶1的三羟甲基氨基甲烷饱和酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，混匀后，10000～12000r/min，离心8～10分钟；取上清并加入2～2.5倍体积预冷至4℃的无水乙醇，混匀，室温下放置20～30分钟以沉淀DNA；10000～12000r/min，离心5～10分钟；去上清，用体积浓度为70～75％乙醇洗涤1～2次，让乙醇彻底挥发；将其沉淀溶于10～50μl试剂C中，即为DNA提取液，2～8℃保存备用；其中：试剂A含有三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、十二烷基硫酸钠和溶菌酶，它们的浓度分别为10～50mM、10～50mM、2～10mg/ml、10～50μg/ml，余量为灭菌水，三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸钠的pH均为8.0；试剂B含蛋白酶K，浓度是0.5～1.0mg/ml，余量为灭菌水；试剂C含有RNase A 10～50μg/ml，三羟甲基氨基甲烷5～20mM，乙二胺四乙酸钠0.5～2mM，余量为灭菌水，pH为8.0；3)PCR：根据需要检测的葡萄球菌肠毒素基因型的个数，取相同数量的PCR管，每支PCR管中加入任意一组PCR引物对，所述PCR引物对由引物1和引物2组成，每支PCR管中加入0.5～1.0μl 25μM引物1，0.5～1.0μl 25μM引物2，1～3μlDNA提取液，2.5单位/μl的Taq酶0.5～1.0μl，2.5～5.0μl 10×PCR buffer，2.0～4.0μl dNTP，所述dNTP为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度为2.5mM，2.0～4.0μl 25mM MgCl2，加灭菌去离子水至50μl；3000～5000r/min离心2～5秒混匀，置于PCR仪内进行扩增；反应条件为：①94～96℃预变性2～5分钟；②94～96℃变性30秒～1分钟；③45～50℃退火40秒～1分钟；④72℃延伸40秒～1分钟，②③④共5～10个循环；⑤94～96℃变性30秒～1分钟；⑥50～55℃退火40秒～1分钟；⑦72℃延伸40秒～1分钟，⑤⑥⑦共25～35个循环；最后72℃延伸6～10分钟；4℃保温6～10分钟，得扩增样品；根据需要检测的葡萄球菌肠毒素基因型，从表1中选择PCR引物对表1：4)PCR扩增产物分析：取5～10μl扩增后的样品，与2～6μl质量比为0.25％的溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.5～1.0μg/ml溴化乙锭的质量比为0.8～1％的琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，如果扩增的核酸条带与表2中扩增长度一致，则可判断被检测的样品是含有相应葡萄球菌肠毒素基因型的阳性样品；表2：