[发明专利]甘蔗宿根矮化病菌的PCR快速检测方法

摘要

本发明涉及甘蔗种苗的繁殖生产技术领域，提出一种甘蔗宿根矮化病菌的PCR快速检测方法，包括取甘蔗汁、蔗汁预处理、改良优化CTAB法提取RSD的基因组DNA、PCR扩增、电泳检测等步骤，其中电泳检测是将PCR扩增步骤的PCR产物经过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳后于0.1％的硝酸银液中染色10分钟，用双蒸水清洗1-2次，然后再于显色液(1.5％NaOH，0.15％甲醛，)显色，后观测结果。本发明有如下突出特点和显著进步：1.检测快速、结果稳定，从大田取蔗汁起到得出检测结果只需8小时，且检测结果稳定。2.可以大批量检测，本发明仅需1～2mL甘蔗蔗汁，蔗汁采集方便不需要特殊设备，操作简单，可以进行批量化检测，一个熟练的技术人员每天可以检测800个以上样品。3.检测结果准确、灵敏度高，本发明在蔗汁前处理中能有效去除甘蔗蔗汁中蔗蜡等次生物质对RSD的DNA影响，获取DNA纯度高，PCR过程干扰较小，RSD的电泳结果准确可靠、灵敏度高。

主权项

1.甘蔗宿根矮化病菌的PCR快速检测方法，包括如下步骤：步骤一、取甘蔗汁：随机在大田中取一段甘蔗，挤压取1～2mL甘蔗蔗汁保存；步骤二、蔗汁预处理：高速离心去掉蔗汁上清，留沉淀；步骤三、改良优化CTAB法提取RSD的基因组DNA；步骤四、PCR扩增；步骤五、电泳检测；其特征在于：步骤四中进行PCR检测的特异PCR引物为：上游引物：5’-AAAAGGTCCAGAGGATTCGGTTC-3’下游引物：5’-GTTTTCAACGCAGAGATTGTCCA-3’步骤五的电泳检测是将步骤四的PCR产物经过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳后于0.1％的硝酸银液中染色10分钟，用双蒸水清洗1-2次，然后再于显色液(1.5％NaOH，0.15％甲醛，)显色，后观测结果。