[发明专利]柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联方法及其产物有效
| 申请号： | 200910013710.7 | 申请日： | 2009-01-05 |
| 公开（公告）号： | CN101585864A | 公开（公告）日： | 2009-11-25 |
| 发明（设计）人： | 张旋;马光辉;苏志国;祁庆生;雷建都 | 申请（专利权）人： | 天津派格生物技术有限公司;中国科学院过程工程研究所 |
| 主分类号： | C07K1/10 | 分类号： | C07K1/10;C07K1/18;C07K14/535;A61K38/19;A61P7/00 |
| 代理公司： | 济南金迪知识产权代理有限公司 | 代理人： | 王绪银 |
| 地址： | 300457天津市经济技术开*** | 国省代码： | 天津;12 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | 本发明公开了一种柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法，其中所述偶联方法中1)层析介质优选阳离子交换介质；2)层析柱柱床高度优选推荐柱高的上限；3)rhG-CSF蛋白的上样量优选为介质实测最大载量的30-50％；4)以较低的上样流速、较长的上样时间(3～5小时)、较高反应率的pH值上样活化的mPEG；5)活化的mPEG的上样量按活化的mPEG与rhG-CSF的反应量比为1～50mol∶1mol进行；6)以0.5M～1M氯化钠盐溶液梯度洗脱。本发明还公开了所述方法制得的偶联化合物，即聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子，其结构式为：CH3-(CH2CH2-O)n-(CH2)r-NH-rhG-CSF或CH3-(CH2-CH2-O)n-(CH2)r-NH-rhG-CSFm，式中n为570～2200，r为1～3；以及所述偶联化合物作为制备防治粒细胞减少症制剂的应用。 | ||
| 搜索关键词： | 层析 粒细胞 集落刺激因子 定点 方法 及其 产物 | ||
【主权项】：
1.一种柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法，步骤包括：选择阳离子交换介质，装载于层析色谱柱中，柱床高度为常规推荐高度的上限，并将其连接到液相层析系统上；使用相当于5～6倍柱体积的pH 3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液和质量百分比为0.005％聚山梨醇酯80充分平衡色谱柱；用进料泵，以8～10ml/min的流速，将rhG-CSF或rhG-CSFm原液加入层析柱中，上样量为介质实测最大载量的10％～70％；再在13～15ml/min的流速下，用5～6倍柱体积的pH 3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；按mPEG∶rhG-CSF或rhG-CSFm的反应量比为1～50mol∶1mol的比例，以0.5～3ml/min的流速上样加入分子量范围为26～40kDa的单甲基PEG，所述不同分子量的mPEG投入总量X按公式(1)计算：(1)X＝5～50×m×MWPEG/MWG-CSF式中：X为不同分子量的mPEG投入总量，m为加入的rhG-CSF蛋白含量，MWPEG和MWG-CSF分别为mPEG和G-CSF的分子量；再按公式(2)计算还原剂氰基硼氢化钠的加入量：(2)NaBH3CN加入量＝10×MW还原剂×X/MWPEG式中：MW还原剂为还原剂氰基硼氢化钠的分子量，X为不同分子量的mPEG投入总量，MWPEG为mPEG的分子量；连续上样240±5分钟；反应体系的pH为3.5～6.0；再以13～15ml/min的流速，用5～6倍柱体积的pH 3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；随后用pH 3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液与0.5M～1M氯化钠的混合液，以洗脱方式0～8％、8％～18％和18％～100％洗脱，持续150±2分钟，获得三个洗脱峰，即P1，P2和P3，其中P2的峰面积占总峰面积的90±1％，为单修饰的PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm，即聚乙二醇与rhG-CSF或rhG-CSFm蛋白N-末端单一、定点特异性偶联化合物；其中：上述rhG-CSF或rhG-CSFm的氨基酸序列应符合SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列公式，其中所述rhG-CSFm为N-末端敲除1～10位氨基酸而N-末端氨基酸仍为蛋氨酸的rhG-CSF；上述单甲基PEG指能与蛋白质氨基偶联的各种活化的单甲基PEG分子，为mPEG-ALD或mPEG-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯中的PEG-琥珀酰亚胺α甲基丁酸酯或mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯。
下载完整专利技术内容需要扣除积分，VIP会员可以免费下载。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于天津派格生物技术有限公司;中国科学院过程工程研究所，未经天津派格生物技术有限公司;中国科学院过程工程研究所许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/patent/200910013710.7/，转载请声明来源钻瓜专利网。
- 上一篇：一种油浸式单相升压变压器
- 下一篇：光纤复合绝缘子及其制备方法
- 同类专利
- 一种用于极微量蛋白交联的试剂盒-201721278094.4
- 吴娟;冷毅斌;王长乐;胡勤芹;刘旻 - 武汉巴菲尔生物技术服务有限公司
- 2017-09-30 - 2018-09-04 - C07K1/10
- 本实用新型涉及一种用于极微量蛋白交联的试剂盒，包括盒体和盖体，所述盒体为顶部开口的长方体状，所述盖体可拆卸连接于所述盒体的顶部开口处，所述盒体内设有固定瓶托，所述固定瓶托上表面的一侧均匀间隔设置有五个竖直的圆柱体凹槽,五个所述圆柱体凹槽沿所述盒体的长边方向排成一排，所述固定瓶托另一侧的一端设有两个沿所述盒体的宽边方向并排设置的试剂瓶卧槽，所述固定瓶托另一侧的另一端设有四个沿所述盒体的宽边方向并排设置的超滤离心管卧槽。有益效果是：提供了蛋白交联所需的全部试剂，包装紧凑，蛋白交联过程操作简单,能够偶联最少10μg的蛋白，并且特异性好，减少蛋白的自交联。
- 一种用于抗体‑分子定点偶联的方法及应用-201710864001.4
- 蔡红东;陈昌岳;刘关;段彪;李静;张祥林 - 上海美吉医学检验有限公司
- 2017-09-22 - 2017-12-22 - C07K1/10
- 本发明利用酶法和化学法相结合，提供一种最佳的抗体‑分子定点偶联方案首先通过酶法对抗体Fc片段的糖苷位点进行脱糖基化暴露出不同位置和个数的GlcNAc位点；然后由相应的酶或突变体通过转糖基作用将半乳糖UDP‑Gal或修饰有特殊官能团的供体半乳糖衍生物修饰到抗体的GlcNAc位点，其中对于修饰有半乳糖Gal末端的抗体还需利用唾液酸糖基转移酶将修饰有特殊官能团的供体唾液酸衍生物修饰到抗体的Gal末端位点，从而获得带有特殊官能团修饰的抗体；最后利用化学反应将带有特殊官能团的其他分子物质定点偶联在抗体的Fc区。本方案可以准确、可控地得到不同位置和个数的裸露的抗体的GlcNAc位点，使得抗体定点偶联上相同个数的其他分子，实现抗体‑分子定点偶联。
- 用于肽合成的方法和用于实施肽固相合成方法的装置-201580063451.2
- S·克瑙尔;T·M·L·勒泽;O·阿鲁狄那;H·科尔马;C·乌特 - 苏尔福工具股份有限公司
- 2015-09-29 - 2017-09-26 - C07K1/10
- 本发明涉及肽合成的方法，其中所述方法包括以下步骤使第一氨基酸或第一肽与α‑胺保护的第二氨基酸在溶剂中反应，所述溶剂选自水、醇，和水与醇的混合物，和采用脱保护溶液除去α‑胺保护基。本发明还涉及保护剂、它们的用途和用于实施肽固相合成方法的装置。
- 在升高的温度下合成肽的改进偶联方法-201510959243.2
- J·M·柯林斯;S·K·辛格 - CEM有限公司
- 2015-12-18 - 2016-06-29 - C07K1/10
- 本发明涉及在升高的温度下合成肽的改进偶联方法。公开了一种用于将羧酸和胺偶联的改进方法，其包括以下步骤：组合连接胺和树脂的高酸敏感性连接子、羧酸、碳二亚胺、活化剂添加剂和碱性物质；并在大于30℃的温度下进行活化和偶联。
- 一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法-201510848044.4
- 张颖;王德龙;王仁友;李同金;石鑫磊 - 济南康和医药科技有限公司
- 2015-11-27 - 2016-02-24 - C07K1/10
- 本发明属于多肽合成领域，特别涉及一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法。本发明首先采用固相合成法制备得片段X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OH，再与以液相法制得的片段H-Pro-Leu-Gly-NH2进行偶联反应，得到卡贝缩宫素线性肽，然后在液相中进行线性肽的环化反应制得卡贝缩宫素。此法操作过程简便，生产成本低，并且能够避免甘氨酸缺失肽杂质的产生，有利于后续的纯化过程，适宜大规模生产。
- 一种多肽的制备方法-201310242802.9
- 潘俊锋;刘建;马亚平;袁建成 - 深圳翰宇药业股份有限公司
- 2013-06-18 - 2013-09-18 - C07K1/10
- 本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种多肽的制备方法。该方法包括如下步骤：获得第一多肽片段-第一树脂、第二多肽片段-第二树脂、第三多肽片段、第四多肽片段、氨基端乙酰化的第五多肽片段；脱除第二多肽片段-第二树脂中Glu和Lys的侧链保护基，经环化、第一裂解，获得第二多肽片段；依次将第二多肽片段、第三多肽片段、第四多肽片段、氨基端乙酰化的第五多肽片段与第一多肽片段-第一树脂偶联，获得肽树脂，经第二裂解、纯化、冻干，即得。本发明提供的制备方法合成周期短，合成杂质少，易纯化，可提高最终产品的收率。
- 载有多肽缩合剂的多孔材料，及其制备方法和用途-201310028587.2
- 吕敏杰;朱勇;唐莉 - 苏州昊帆生物科技有限公司
- 2013-01-25 - 2013-05-15 - C07K1/10
- 本发明提供了一种载有多肽缩合剂的多孔材料，多肽缩合剂吸附于多孔材料中，多肽缩合剂为HOAT或HOBT或HOOBT，多孔材料为硅藻土或分子筛或硅胶。本发明提供了上述载有多肽缩合剂的多孔材料的制备方法，包括将多肽缩合剂吸附于多孔材料的步骤，所述吸附是将多肽缩合剂溶解于有机溶剂后，均匀地分散于多孔材料内以及多孔材料表面。另外，本发明还进一步提供了载有多肽缩合剂的多孔材料用于催化有机胺和酸反应形成酰胺键的用途。本发明所提供的多孔材料可解决多肽缩合剂在储存或运输过程中所存在的安全问题，且制备简单，成本低，热稳定性好，不需要解吸附而可直接参与反应，且不影响其产品收率，具有非常好的应用前景。
- 通过在多个单体与特异性结合单体的粘合体的重复链的复合物中增加键桥的产量以生产二聚体和多聚体的方法-200980163448.2
- 崔武铉;李镕粲;元哉善 - 崔武铉
- 2009-12-15 - 2012-11-07 - C07K1/10
- 本发明涉及生产多聚体的方法，在多聚体中多个单体通过键桥连接，该方法通过制备含有重复连接的特异性结合单体的粘合体的重复链，以及通过使用上述物质产生重复链/多个单体复合物(该复合物由重复链和多个单体产生)，从而有助于复合物中单体之间键桥的形成。更具体地，本发明涉及生产多聚体的方法，在多聚体中多个单体通过键桥连接，该方法通过制备由重复连接的特异性结合蛋白单体的粘合蛋白产生的重复链重组蛋白，以及通过使用上述物质产生重复链/多个单体复合物(该复合物由重复链和多个单体产生)，从而有助于复合物中单体之间键桥的形成。更具体地，本发明涉及生产多聚体的方法，在多聚体中多个单体通过二硫键桥连接，该方法通过制备由重复连接的特异性结合蛋白单体的粘合蛋白产生的重复链重组蛋白，以及通过使用上述物质产生重复链/多个单体复合物(该复合物由重复链和多个单体产生)，从而有助于复合物中单体之间二硫键桥的形成。更具体地，本发明涉及生产二聚体和多聚体的方法，在二聚体和多聚体中多个单体通过二硫键桥连接，该方法通过使用含有由链球菌蛋白G的域Ⅲ(Fab结合域)的重复连接产生的重组重复链蛋白的骨架，由抗体蛋白的单体产生重复链及其多个单体复合物，从而有助于复合物中单体之间二硫键桥的形成。本发明的方法可有利地用于大量生产二硫键桥二聚体，因为与现有技术中已知的重折叠方法相比，其在二硫键桥二聚体产量方面提供了高达200倍的改进。
- 一种三聚氰胺抗原及其制备方法和应用-201010613333.3
- 雷红涛;孙远明;王强;黄启欣 - 华南农业大学
- 2010-12-30 - 2011-08-03 - C07K1/10
- 本发明公开了一种三聚氰胺抗原及其制备方法和应用。本发明三聚氰胺抗原是采用2,4-二氨基-6-肼基-1,3,5三嗪与蛋白质偶联得到。采用本发明三聚氰胺抗原免疫实验动物得到的三聚氰胺特异性抗体，最低检测限（LOD值）为0.9ng/mL，与三聚氰酸、莠去津、三聚氯氰等无交叉反应，特异性好，可用于三聚氰胺的免疫检测，实现三聚氰胺的安全监控。
- GLP-1类似物的半重组制备法-200880124022.1
- J·F·刘;A·S·安德森;P·布洛克;J·刘;P·W·加里贝;T·克鲁斯;I·S·N·诺比;C·U·杰森;C·克里斯滕森;J·C·诺里尔德 - 诺沃-诺迪斯克有限公司
- 2008-12-22 - 2010-12-08 - C07K1/10
- 本发明涉及结合使用重组表达技术和化学肽合成法产生在N端部分含非蛋白氨基酸的GLP-1类似物和衍生物的半重组方法。
- 一种多肽缩合剂及其合成方法-200910212682.1
- 王喆;冯亚兵;岳邦毅;陈强;庄韦 - 常州南京大学高新技术研究院
- 2009-11-12 - 2010-05-05 - C07K1/10
- 一种多肽缩合剂，它有如下结构通式：
其中R1-基团可以是氢、给电子基团或吸电子基团，其可以在6-位，也可以在7-位，R2-可以是甲基或乙基。本发明的多肽缩合剂对多肽缩合的效果超过了DEPBT，同样条件下的多肽缩合产率比DEPBT等常见多肽缩合剂高出10～50％，缩合反应操作简单。本发明公开了其制法。
- 柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联方法及其产物-200910013710.7
- 张旋;马光辉;苏志国;祁庆生;雷建都 - 天津派格生物技术有限公司;中国科学院过程工程研究所
- 2009-01-05 - 2009-11-25 - C07K1/10
- 本发明公开了一种柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法，其中所述偶联方法中1)层析介质优选阳离子交换介质；2)层析柱柱床高度优选推荐柱高的上限；3)rhG-CSF蛋白的上样量优选为介质实测最大载量的30-50％；4)以较低的上样流速、较长的上样时间(3～5小时)、较高反应率的pH值上样活化的mPEG；5)活化的mPEG的上样量按活化的mPEG与rhG-CSF的反应量比为1～50mol∶1mol进行；6)以0.5M～1M氯化钠盐溶液梯度洗脱。本发明还公开了所述方法制得的偶联化合物，即聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子，其结构式为：CH3-(CH2CH2-O)n-(CH2)r-NH-rhG-CSF或CH3-(CH2-CH2-O)n-(CH2)r-NH-rhG-CSFm，式中n为570～2200，r为1～3；以及所述偶联化合物作为制备防治粒细胞减少症制剂的应用。
- 一种用N-杂环卡宾催化制备肽的方法-200910026609.5
- 李振江;盛士川;张昊;宋萍;郭畅;陈伟华;吴璇;薛金红;韦萍;欧阳平凯 - 南京工业大学
- 2009-05-06 - 2009-09-30 - C07K1/10
- 本发明公开了一种N-杂环卡宾催化制备肽的方法，属于高分子材料领域。该方法以N-杂环卡宾作为催化剂，加入亲核合物作为引发剂，开环聚合各种保护和未保护的α-氨基酸-N-羧基内酸酐(NCA)，反应温度为-50℃～250℃，N-杂环卡宾、起始剂和NCA按摩尔比1∶0.2～5∶2～10000，反应时间为3秒～120小时制备肽。该方法催化剂反应活性高，反应速度快，反应条件相对温和，不引入金属离子，无设备腐蚀，产物后处理简单。
- 一种新型高效多肽合成缩合剂-200810085324.4
- 杨顶建;姜月霞 - 海南建邦制药科技有限公司
- 2008-03-06 - 2009-09-09 - C07K1/10
- 本发明涉及多肽合成缩合剂，主要用于多肽固相合成缩合反应。本发明的缩合剂中含有HATU、HBTU、NMM、DIPEA、HOBT，缩合剂中各组分的重量百分比为：HATU 0.1％-0.4％、HBTU 0.6％-0.9％、NMM 1％-3％、DIPEA1％-3％、HOBT 1％-5％。本发明的多肽合成缩合剂由以上组分构成的合理配比，提高反应活性，抑制消旋，有效进行缩合，减少缩合试剂和氨基酸的用量，并提高多肽的产率，降低生产成本。
- 柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联方法及其产物-200910013711.1
- 张旋;苏志国;祁庆生 - 天津派格生物技术有限公司
- 2009-01-05 - 2009-08-12 - C07K1/10
- 本发明公开了一种柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联的方法，是通过离子交换层析将IFNs类似物(IFNs Analogs，IFNs-A)上的赖氨酸epsilon氨基“封闭”而实现PEG-ALD与IFNs-A N-末端蛋氨酸alfa氨基的特异性偶联，并同时实现一步纯化获得单一、定点N-末端偶联PEG-IFNs-A产物。本发明还进一步公开了所述聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白在制备治疗乙型或丙型病毒性肝炎、多发性硬化症、风湿或类风湿性关节炎、恶性肿瘤、毛白血病和艾滋病卡波氏瘤药物中的应用。
- 专利分类
