[发明专利]黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法

摘要

本发明公开了一种黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法，包括黄颡鱼XY性染色体特异AFLP标记的筛选和克隆，黄颡鱼XY性染色体特异SCAR标记的设计，黄颡鱼性染色体基因型(XX/XY/YY)PCR鉴定方法的建立。本发明建立了黄颡鱼性染色体特异AFLP标记筛选方法，从256个AFLP引物组合中筛选到3个引物组合能够产生4个X或Y染色体特异AFLP片段，创建了黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法。本发明首次筛选到黄颡鱼X和Y染色体特异分子标记，建立了黄颡鱼遗传性别鉴定方法，并将本方法应用到全雄黄颡鱼培育过程中的遗传性别鉴定。本发明具有高效，准确和稳定的特点，在黄颡鱼性别控制和全雄黄颡鱼苗种的持续规模化生产中具有重要的应用价值。

主权项

1、一种黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法，它包括以下步骤：A. 筛选和克隆黄颡鱼XY性染色体特异AFLP标记，首先是XY性染色体特异的AFLP标记筛选，从黄颡鱼XX雌鱼、XY雄鱼和YY超雄鱼尾鳍样品中提取基因组DNA，通过琼脂糖电泳及分管光度计来检测DNA的浓度，最终将DNA浓度稀释成30ng/μl，AFLP筛选包括以下步骤：1)使用MseI和EcoRI限制性内切酶对DNA模板进行酶切；2)使用T4DNA连接酶，将特异接头连接到酶切片段两端；3)进行预扩增；4)进行选择性扩增；5)电泳分析；使用256个引物组合进行AFLP选择性扩增，其中3个引物组合扩增出2个X染色体特异AFLP片段和2个Y染色体特异AFLP片段，为：编号62引物组合，序列为SEQ IDNO.1的上游引物E6和序列为SEQ ID NO.2的下游引物M2，在所有XY和YY个体中均扩增出一个大小为233bp的特异片段，同时编号33引物组合，序列为SEQID NO.3的上游引物E3和序列为SEQ ID NO.4的下游引物M3，在所有XY和YY个体中均扩增出一个大小为226bp的特异片段，这两个特异片段在所有XX个体的扩增产物中不出现，将这类只在所有XY和YY个体中出现，在XX个体中不出现的片段作为Y染色体特异AFLP片段；另外，编号62引物组合，在所有XX和XY个体中均扩增出一个大小为239bp的特异片段，同时63号引物组合，序列为SEQ ID NO.1的上游引物E6和序列为SEQ ID NO.4的下游引物M2，在所有XX和XY个体中均扩增出一个大小为226bp的特异片段，这两个片段在所有YY个体中不出现，将这类只在所有XX和XY个体中出现，在YY个体中不出现的片段作为X染色体特异AFLP片段；其次是性染色体特异AFLP标记的克隆与序列分析，其步骤是：1)黄颡鱼XY性染色体特异AFLP片段的回收；2)性染色体特异AFLP片段的克隆；3)性染色体特异AFLP片段的序列分析；克隆了黄颡鱼X染色体特异AFLP片段和Y染色体特异AFLP片段，分别命名为Pf-Y62、Pf-Y33、Pf-X62和Pf-X63，其序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；序列分析显示：性染色体特异AFLP片段Pf-X62和Pf-Y62为黄颡鱼X和Y染色体上的一对等位序列，它们的序列差异在于6个碱基的插入或缺失以及1个碱基的替换；性染色体特异AFLP片段Pf-X33和Pf-Y63是黄颡鱼X和Y染色体上的一对等位序列，它们的序列差异在于1个碱基的替换；B. 转化为XY性染色体特异SACR标记：首先是染色体步移获得性染色体特异片段的侧翼序列：通过三轮扩增，扩增到黄颡鱼XY性染色体特异等位序列的侧翼片段，将片段回收、克隆和测序；其次是序列分析比对：从染色体步移获得的侧翼序列中选择大小为311bp-624bp的片段用于序列分析，其序列分别为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列；通过分析比对性染色体特异等位序列分别在黄颡鱼X和Y染色体上拷贝的序列差异，发现一批稳定的X和Y染色体序列差异位点，用来区分X或Y染色体；从中选择X和Y性染色体存在序列差异的位点，设计了引物，分别为：1)Y染色体特异标记Pf-Y62引物：由序列为SEQ ID NO.14的上游引物Pf-XY62L和序列为SEQ IDNO.15的下游引物Pf-Y62R组合；2)X染色体特异标记Pf-X62引物：由序列为SEQ ID NO.14的上游引物Pf-XY62L和序列为SEQ IDNO.16的下游引物Pf-X62R组合；3)Y染色体特异标记Pf-Y33引物：由序列为SEQ ID NO.17的上游引物Pf-Y33L和序列为SEQ ID NO.18的下游引物Pf-Y33R组合；4)X染色体特异标记Pf-X63引物：由序列为SEQ ID NO.19的上游引物Pf-X63L和序列为SEQ ID NO.20的下游引物Pf-X63R组合；第三是转化为SCAR标记：采用上一步设计的特异引物，在黄颡鱼XX，XY和YY个体基因组DNA中扩增，PCR反应体系为25μl：2.5μl10×PCR buffer，2.0μl25mM Mgcl2，1U TaqDNA聚合酶，0.5μl10mM dNTP，0.5uM上下游引物，20ng DNA，加水至25μl，扩增条件分别为：Pf-Y62或Pf-X62：94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，循环数为36；Pf-Y33或Pf-X63：94℃ 30s，65℃/-0.5℃ 30s，72℃ 30s，循环数为10；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，循环数为25；C. 建立黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法包括：1)取样和DNA提取：采集黄颡鱼尾鳍样品，贮存于无水乙醇中，提取基因组DNA；2)PCR反应：选用所设计的4个SCAR标记中的任意一个X染色体特异SCAR标记和一个Y染色体特异SCAR标记作为组合，分别在黄颡鱼样品基因组DNA中扩增，PCR反应体系和扩增条件为步骤B转化为XY性染色体特异SACR标记中的第三转化为SCAR标记所述；3)结果判断：根据样品的扩增结果来判断其性染色体基因型：扩增出X染色体特异SCAR特异标记片段，扩增不出Y染色体特异SCAR标记片段的个体为遗传XX个体；扩增出X染色体特异SCAR标记片段，扩增出Y染色体SCAR标记片段的个体为遗传XY个体；扩增出Y染色体特异SCAR标记片段，扩增不出X染色体特异SCAR标记片段的个体为遗传YY个体；D. 在全雄黄颡鱼培育中进行遗传性别鉴定包括：a.XX雌鱼×XY雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定：剪取黄颡鱼尾鳍样品，提取基因组DNA，采用步骤C所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法，选用Y染色体特异SCAR标记Pf-Y62引物扩增各样品DNA，根据扩增结果判断样品的遗传性别，能够扩增出一个大小为568bp特异片段的个体为遗传XY鱼，不能扩增出该特异片断的个体为遗传XX鱼；b.XY雌鱼雌核发育组合子代遗传性别鉴定：采集XY雌鱼雌核发育组合子代XX雌鱼、XY雄鱼和YY超雄鱼尾鳍样品，提取基因组DNA，采用步骤C所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法，选用4个SCAR标记所对应的引物组合，分别在各样品基因组DNA中扩增，根据扩增结果判断各样品的遗传性别，XX雌鱼样品能够扩增出X染色体特异SCAR标记片段，不能扩增出Y染色体特异SCAR标记片段；XY雄鱼样品均能扩增出X染色体特异SCAR标记片段，能扩增出Y染色体SCAR标记片段；YY超雄鱼样品能扩增出Y染色体特异SCAR标记片段，扩增不出X染色体特异SCAR标记片段；c.YY生理雌鱼×XY雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定：从YY生理雌鱼×XY雄鱼交配组合子代中抽取114尾鱼，剪取尾鳍，提取基因组DNA，采用步骤C所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法，选用Pf-Y62和Pf-X63标记进行遗传性别鉴定，结果显示Pf-Y62引物组合在所有样品中能扩增出一个片段大小为568bp的特异片段，Pf-X63引物在57个样品中能够扩增出一个片段大小为462bp的特异片段，在另57个样品无扩增产物，在114尾子代中有57尾YY超雄鱼和57尾XY雄鱼；d.YY生理雌鱼×YY超雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定：从YY生理雌鱼×YY超雄鱼交配组合子代剪取尾鳍，提取基因组DNA，按照步骤C所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法，选用Pf-Y62和Pf-X62两个标记进行遗传性别鉴定，扩增结果显示，Pf-Y62引物组合在所有样品中能扩增出一个片段大小为568bp的Y染色体特异片段，Pf-X62引物组合在所有样品中无扩增产物，表明所有子代为YY超雄鱼；e.XX雌鱼×YY超雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定：从步骤c和d所鉴定得到的YY超雄鱼中选取YY超雄鱼，性成熟后与XX雌鱼进行交配，测交子代长至4个月时，抽取400尾仔鱼，解剖后根据组织学判断性腺形态为精巢或卵巢来判断鱼的性别，解剖结果显示，所有400尾鱼为雄鱼；同时从中随机抽取20尾鱼剪取尾鳍，提取基因组DNA，按照步骤C所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法，选用Pf-Y62标记于样品中扩增，所有个体能扩增出一个片段大小为568bp的特异片段，为遗传上的雄鱼。