[发明专利]磁珠富集法筛选日本沼虾微卫星标记的方法

摘要

本发明的磁珠富集法筛选日本沼虾微卫星标记的方法，包括提取日本沼虾的基因组DNA；探针与目的片段杂交；磁珠富集；阳性克隆测序并根据微卫星侧翼序列涉及引物扩增基因组DNA。本发明由于采用磁珠富集结合菌液PCR扩增进行第二次筛选，不需要使用同位素，具有安全高效，而且成本低、周期短、可靠性高等优点。同时，在富集的过程中，磁珠经过多次重复洗涤，能将一些因重复数目较少而附着不牢的微卫星序列清洗除去，致使所获得的微卫星序列较长，重复次数较多。而重复次数较多的微卫星序列被认为在种间和种内都具有丰富的多态性，能够被广泛应用于种质多样性鉴定、遗传图谱构建、QTL中。因此本方法是一种易于推广的筛选日本沼虾微卫星标记的方法。

主权项

1、一种磁珠富集法筛选日本沼虾微卫星标记的方法，包括提取日本沼虾的基因组DNA；探针与目的片段杂交；磁珠富集；阳性克隆测序并根据微卫星侧翼序列涉及引物扩增基因组DNA；其特征在于所述提取日本沼虾的基因组DNA包括以下步骤：1)取活体日本沼虾肌肉组织约200mg于1.5mLEppendorf管中，剪碎，加入665μl抽提缓冲液(Tris.Cl：10mM，PH＝8.0；EDTA：0.1mM，PH＝8.0)，再加入35μlSDS(0.5％)以及10μl蛋白酶K(20mg/mL)，55℃水浴消化过夜；2)加入等体积的饱和酚(700μl)经DNA混匀仪缓慢混合30min后，冷冻离心机12000转/min离心10min抽提一次；3)取上清液加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)(700μl)，经DNA混匀仪缓慢混合15min后，经冷冻离心机12000转/min离心15min抽提一次；4)取上清液加入等体积的氯仿(700μl)，经DNA混匀仪缓慢混合10min后，经冷冻离心机12000转/min离心10min抽提一次；5)取上清液，加入二倍体积预先冷冻的无水乙醇，轻轻摇晃混匀后，12000转/min离心10min，将DNA沉淀于管底，弃上清；6)加入50μl乙醇(70％)，洗涤沉淀两次，放入37℃干燥箱中烘干得日本沼虾基因组总DNA，再加入100μl无菌水溶解DNA，4℃冰箱保存；使用DNA定量仪定量其浓度及纯度，然后在琼脂糖凝胶上检测。