[发明专利]一种检测血样中的PON-1酶活性的方法及应用

摘要

本发明公开了一种检测血样中的PON-1酶活性的方法及应用，其步骤：(a)利用对氧磷作为底物，测定来自血清或血浆样品中对氧磷酯酶-1(paraoxonase-1，PON-1)的活性；(b)免疫透射比浊法测量样品中载脂蛋白AI(apo AI)的水平；(c)计算PON-1活性与apo AI水平的比值；(d)将所计算的比值与指示存在或不存在冠心病的至少一种已知指标进行比较。本发明通过反映HDL颗粒中PON-1的相对活性，特异、敏感地对冠心病危险性的存在进行评估。将酶活性的测定作为制备治疗或预防在冠心病、心肌梗塞等心脑血管疾病药物中的应用。PON-1是HDL中发挥主要抗氧化功能的特征性抗氧化酶，其活性的检测可以反映HDL抗氧化的功能，从而作为冠心病的危险性评价的方法和工具。

主权项

1.一种检测血样中的PON-1酶活性的方法，其步骤是：(1)测量：采用酶水解特异底物对氧磷为对硝基酚，测定来自血清或血浆样品中PON-1的酶活性，在含Ca²⁺的Tris-Cl缓冲液，pH 8.5分析体系中，于酶标仪405nm处连续扫描记录4min内酶促反应产物的生成速率，酶活性以每毫升血清每分钟生成对硝基酚的纳摩尔数，其方法如下：(a)受试者均被收集禁食、禁饮12小时后的新鲜肘静脉血，分离分装血清或血浆，一份测定血脂全套指标，另一份血浆或血清于-80℃冻存，用于测定酶活性；(b)-80℃冻存的血样冰上解冻，用微量移液器准确吸取5μl血清或不含EDTA的血浆，置于96孔酶标板孔中，于每孔加入95μl 100mmol·L^-1 Tris-Cl缓冲液，含2.0mol·L^-1NaCl，2.0mmol·L^-1CaCl₂，pH 8.5，于室温下，使用多道移液器于每孔同步加入2×底物反应液100μl，Tris-Cl缓冲液中含2.4mmol·L^-1paraoxon，临用前配制，室温下避光放置，反应，于酶标扫描仪上405nm波长处每隔20秒测定一次，记录A₄₀₅，以测量4分钟内吸光度值的平均变化率，ΔA₄₀₅/min；(c)按照酶活性单位的规定定义：每毫升血清每分钟生成对硝基酚的纳摩尔数，nmol·min^-1·mL^-1表示1个PON-1酶活性单位值，用下列计算公式计算出血清中PON-1酶活性水平：其中：ΔA₄₀₅/min＝(A₂-A₁)/(T₂-T₁)；T为测定时间，A为测定时间反应体系在405nm波长处的即时吸光度值；(2)测量：利用全自动生化分析仪采用免疫透射比浊法，测量血清或血浆样品中apo AI的水平；(3)计算PON-1酶活性与apo AI水平的比值：将步骤(1)测量的PON-1酶活性水平值U·mL-1与步骤(2)测量的apo AI水平mg·dL-1进行比较，采用P/A值表示单位HDL颗粒中PON-1的活性值来反映PON-1的抗氧化；P/A值＝PON-1酶活性/apo AI水平其中：PON-1酶活性单位为nmol·min^-1·mL^-1或U·mL^-1；apo AI水平的单位为mg·dL^-1。