[发明专利]生成物为H2O2的氧化酶类活性检测方法

摘要

本发明提供了一种生成物为H₂O₂的氧化酶类活性检测方法，利用氧化酶氧化底物生成H₂O₂，以检测H₂O₂含量从而达到对氧化酶活性的定量检测，反应显色剂选用N，N-二甲苯胺，4-氨基胺替吡啉，显色剂与H₂O₂反应生成紫萝蓝色产物，产物在波长550nm处测定光密度值，以0.001ΔOD₅₅₀·min^-1底为一个酶活单位(U)，通过检测产物浓度来间接地测出氧化酶的活性速率，于传统方法相比，本方法对H₂O₂浓度的最低检测量可从1.25μmol·L^-1提高到0.65μmol·L^-1，从而提高了氧化酶活性的检测率，并且其显色产物具有良好的稳定性和重现性，可以延长反应时间来提高检测效果。

主权项

1、一种生成物为H2O2的氧化酶类活性检测方法，具体操作技术如下：(1)制作氧化酶提取液：称取0.5g试材加入1.6mL磷酸缓冲液(0.1mol·L-1，pH 6.5)于冰浴中研磨后以10000×g离心20min(4℃)，上清液即为氧化酶提取液；(2)制作显色液：100mL显色液(用0.1mol，pH 6.5的磷酸缓冲液配)的成分中含25μL N，N-二甲基苯胺，10mg 4-氨基氨替吡啉；(3)制作反应混合液：该反应混合液含2.5mL磷酸缓冲液(0.1mol·L-1，pH 6.5)，0.2mL显色液，0.2mL氧化酶提取液，0.1mL过氧化物酶溶液(250U·mL-1)；(4)将反应混合液加入20mmol·L-1底物0.1mL起动反应后，混合反应液置于25℃中反应30min，所述底物依氧化酶的种类而定，如检测多胺氧化酶，其底物为多胺；检测多酚氧化酶，其底物为各种酚类；(5)用分光光度计测定波长550nm处光密度值，以0.001ΔOD550·min-1为一个酶活单位(U)；(6)用加入5％高氯酸的提取液为对照。