[发明专利]生成物为H2O2的氧化酶类活性检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物酶活性检测领域，具体涉及以生成物为H₂O₂的氧化酶类活性 的检测，包括植物体内H₂O₂含量的检测。

背景技术：

氧化酶类是生物体氧化代谢过程中的重要物质，决定了生物体内的氧化代 谢进程和次生代谢物质的产生与消除。使植物在不同的生长环境下具有不同的 适应状态。如多胺(Polyamines，PAs)是生物体氮代谢过程中产生的一类次生 代谢物质，植物体在受到生物的和非生物的胁迫时，体内的多胺浓度急剧地变 化。多胺氧化酶(Polyamine oxidase，PAO)是催化生物体内PAs氧化的关键 酶，通过调节细胞的PAs水平和生成物的浓度，参与各种植物体对逆境胁迫的 反应和生长发育过程。因而PAO是PAs代谢研究的一个重要环节；而多酚氧化 酶是氧化酚类的关键酶，是研究酚类氧化代谢的关键酶。诸如此类氧化酶在植 物体内还有很多。这类氧化酶的共同特点是氧化底物时有产物H₂O₂的生成。从而 可以检测H₂O₂含量以达到对氧化酶活性的定量检测。传统检测方法是1972年 Smith提出并应用的PAO活性的检测方法。但由于其灵敏性较低和检测产物稳定 性较差等，在很多植物中都检测不到PAO的活性。影响了传统检测方法应用的 广泛性。

发明内容：

本发明的目的就是提供一种生成物为H₂O₂的氧化酶类活性检测方法，该检 测方法能提高氧化酶活性的检测率，H₂O₂浓度最低检测量可从1.25μmol·L^-1提 高到0.65μmol·L^-1。

其具体操作技术如下：

(1)制作氧化酶提取液：称取0.5g试材加入1.6mL磷酸缓冲液(0.1mol·L^-1， pH 6.5)于冰浴中研磨后以10000×g离心20min(4℃)，上清液即为氧化酶 提取液；

(2)制作显色液：100mL显色液(用0.1mol，pH 6.5的磷酸缓冲液配)的 成分中含25μL N，N-二甲基苯胺，10mg 4-氨基氨替吡啉；

(3)制作反应混合液：该反应混合液含2.5mL磷酸缓冲液(0.1mol·L^-1， pH 6.5)，0.2mL显色液，0.2mL氧化酶提取液，0.1mL过氧化物酶溶液(250 U·mL^-1)；

(4)将反应混合液加入20mmo l·L^-1底物0.1mL起动反应后，混合反应液 置于25℃中反应30min。所述底物依氧化酶的种类而定，如检测多胺氧化酶， 其底物为多胺；检测多酚氧化酶，其底物为各种酚类；

(5)用分光光度计测定波长550nm处光密度值，以0.001 ΔOD₅₅₀·min^-1为 一个酶活单位(U)。

(6)用加入5％高氯酸的提取液为对照。

本发明的方法，H₂O₂浓度的最低检测量可从1.25μmol·L^-1提高到0.65μ mol·L^-1，提高了氧化酶活性的检测率。并且其显色产物具有良好的稳定性与重 现性，可以延长反应时间来提高检测效果。