[发明专利]环介导等温扩增－纳米硫化镉标记电化学检测单增李斯特菌的方法

摘要

本发明涉及一种环介导等温扩增－纳米硫化镉标记电化学检测单增李斯特菌的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：环介导等温扩增反应得到扩增反应物－待测单增李斯特菌的双链目标序列、将该双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在金电极表面自组装固定，即得到待测单增李斯特菌的目标序列修饰电极、然后将纳米硫化镉对来源于单增李斯特菌的探针序列进行标记得到标记探针序列，将该标记探针序列与目标序列修饰电极上的目标序列进行分子杂交并进行同位镀汞阳极溶出法的电化学测定，检测出与检测单增李斯特氏菌种属特异性基因(actA)相应的镉离子。本发明优点是快速、特异性强、灵敏度高而且使用方便。

主权项

1.一种环介导等温扩增-纳米硫化镉标记电化学检测单增李斯特菌的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：首先用环介导等温扩增反应得到扩增反应物--待测单增李斯特菌的双链目标序列、将该双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在金电极表面自组装固定，即得到待测单增李斯特菌的单链目标序列修饰电极、然后将纳米硫化镉对来源于单增李斯特菌的探针序列进行标记得到标记探针序列，将该标记探针序列与目标序列修饰电极上的目标序列进行分子杂交，并以同位镀汞阳极溶出法进行电化学测定，所得电化学信号即为电化学检测单增李斯特菌的依据，且环介导等温扩增反应中含有(1)和(2)溶液：(1)环介导等温扩增反应液：包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱，1U/μL UNG酶；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；其中所述上游内引物：5-AGGGGTTGGTTTTTTAGTCACTGTACGCCATTTAAGAATCCATC-3；下游内引物：5-AAGACCGCACCAAAGCTAGCTGTTTTATTTTCCCTAAGTACGG-3；上游外引物：5-CGGCTCTGATAAGTGACAT-3；下游外引物：5-GCTTGTTTGTTTCTGCTTGTT-3(2)Bst DNA聚合酶：8U/μL。